趙軍寧，鄢良春，羅荔敏

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院國際轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心、中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心 成都 610041；2.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000）

基于Microtox技術(shù)的中藥注射劑毒性早期發(fā)現(xiàn)與質(zhì)量控制技術(shù)研究進展＊

趙軍寧1＊＊，鄢良春1，羅荔敏2

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院國際轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心、中藥藥理毒理研究所/國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室/中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室/四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心 成都 610041；2.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司 雅安 625000）

Microtox技術(shù)（即微毒技術(shù)）是測定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)生物毒性的一種方法，以非致病的發(fā)光細菌作為試驗系，以其發(fā)光強度變化作為檢測指標，日前已成為一種快速、簡便的生物毒性檢測手段。本文概述了本團隊基于Microtox技術(shù)發(fā)展一種能夠反映中藥注射劑特點的早期、靈敏、快速、可靠的新技術(shù)平臺和方法體系，探討解決現(xiàn)有高風(fēng)險中藥注射劑生物評價及檢測方法難以控制其風(fēng)險的難題，實現(xiàn)高風(fēng)險中藥毒性參數(shù)的定量化表征，從而提高中藥質(zhì)量控制和安全性評價的可靠性。

中藥注射劑 Microtox技術(shù) 發(fā)光細菌 微小毒性 生物評價

中藥注射劑是指藥材（飲片）經(jīng)提取、純化后制成的供注入體內(nèi)的溶液、乳狀液及供臨用前配制成溶液的粉末或濃溶液的無菌制劑。中藥注射劑具有療效確切、生物利用度高、作用迅速等特點，突破了中藥傳統(tǒng)的給藥方式，功能較多地集中在清熱解毒、活血化瘀和補益等[1-4]方面，尤在搶救神志昏迷、不能口服的重癥病人和急救等方面，可發(fā)揮著獨特作用。與此同時，中藥注射劑成分復(fù)雜、批間變異度大，風(fēng)險可控性差，監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示約90%的中藥嚴重不良反應(yīng)和預(yù)警信號涉及注射劑型。盡管目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）對中藥注射劑制定了近乎嚴苛的質(zhì)量控制檢測項目，但仍然難以高效發(fā)現(xiàn)與預(yù)測中藥注射劑的不良反應(yīng)，尤其是生物學(xué)評價方法存在耗時、費錢、條件苛刻、可重復(fù)性低、與臨床毒副反應(yīng)不盡一致等問題，難以有效的保證其藥效的一致性和降低其不良反應(yīng)的發(fā)生率。鑒于中藥注射劑復(fù)雜體系和現(xiàn)有測試方法尚難高效測試其綜合毒性的現(xiàn)狀，趙軍寧研究團隊基于Microtox技術(shù)開發(fā)了一種能夠反映中藥注射劑特點的早期、靈敏、快速、可靠的新技術(shù)平臺和方法體系，探討解決現(xiàn)有高風(fēng)險中藥注射劑生物評價及檢測方法難以控制其風(fēng)險的難題，實現(xiàn)高風(fēng)險中藥毒性參數(shù)的定量化表征，提高中藥質(zhì)量控制和安全性評價的可靠性。

1 Microtox技術(shù)[5]

1.1 發(fā)光細菌定義

發(fā)光細菌是一類在生理條件下能夠發(fā)射波長450-490 nm可見熒光的革蘭陰性菌[6]，該熒光屬于冷光，在黑暗處肉眼可見。發(fā)光細菌分為海洋細菌和淡水細菌，海洋細菌包括發(fā)光桿菌屬[7]、希瓦氏菌屬以及弧菌屬中的大多數(shù)，淡水細菌有霍亂弧菌、青?；【?。

1.2 發(fā)光細菌代謝過程和原理

盡管發(fā)光細菌種類繁多，但其發(fā)光機理均屬酶促氧化反應(yīng)。參與細菌發(fā)光反應(yīng)的主要物質(zhì)包括黃素單核甘酸（Flavin Mononucleotide，F(xiàn)MN）、還原型輔酶I（Ⅱ）（NAD（P）H）、熒光酶、分子氧、長鏈脂肪醛（RCHO）等。發(fā)光細菌所合成的熒光酶能夠催化還原型黃素單核苷酸和長鏈脂肪醛，然后在氧的參與下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的能量以光的形式釋放[8]。發(fā)光的代謝過程和原理見圖1。

發(fā)光細菌的發(fā)光強度在一定條件下是恒定的。當(dāng)發(fā)光細菌接觸到無機、有機毒物、抑菌、殺菌物等物質(zhì)時，其細胞膜、酶、及細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，導(dǎo)致其發(fā)光強度發(fā)生改變。發(fā)光強度變化與接觸物質(zhì)毒性呈相關(guān)關(guān)系，毒性越強，發(fā)光抑制率越高。物質(zhì)主要通過直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶類活性及抑制細胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的代謝過程兩條途徑抑制細菌發(fā)光。發(fā)光菌毒性測試是在20世紀70年代后興起的一種微生物監(jiān)測環(huán)境污染及檢測污染物毒性的新方法[10-12]。

2 適合于中藥注射劑毒性快速檢測的Microtox技術(shù)平臺及應(yīng)用

鑒于中藥注射劑復(fù)雜體系和現(xiàn)有測試方法尚難高效、敏感、快速測試其綜合毒性的現(xiàn)狀，本團隊在前期對Microtox技術(shù)測試研究工作基礎(chǔ)上[5,13]，進一步發(fā)展能夠反映中藥注射劑特點的早期、靈敏、快速、可靠的安全性評價的新技術(shù)、新方法和新模型，提高中藥注射劑質(zhì)量控制和安全性評價的可靠性[14-16]。

依托國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測系統(tǒng)數(shù)據(jù)平臺，在中藥注射劑重點關(guān)注品種及其主要毒性風(fēng)險信號、不良反應(yīng)發(fā)生率研究基礎(chǔ)上，探討建立和完善中藥注射劑等高風(fēng)險品種的體外藥物安全性評價替代模型、毒性預(yù)測及快速評價關(guān)鍵技術(shù)，系統(tǒng)研究中藥注射劑對發(fā)光菌發(fā)光強度影響的藥效-毒性效應(yīng)譜、劑量-反應(yīng)曲線和劑量-時間-反應(yīng)關(guān)系，以毒性效應(yīng)動力學(xué)過程、半數(shù)效量（IC50值）等綜合指標，探索和闡明中藥注射劑發(fā)光抑制毒性效應(yīng)（體外試驗）與毒性物質(zhì)/成分、毒性作用和毒靶器官（活體試驗）之間的內(nèi)在規(guī)律，提出活血化瘀類、清熱解毒類等中藥注射劑毒性預(yù)測新技術(shù)及標準?？陀^比較微毒測試新方法評價結(jié)果與傳統(tǒng)毒性評價方法及臨床研究結(jié)果的差異，分析各方法的優(yōu)勢及不足；探討新方法作為中藥注射劑上市前風(fēng)險檢測評價指標的適用性，為高風(fēng)險中藥新藥創(chuàng)制質(zhì)量控制、風(fēng)險預(yù)警和臨床安全用藥提供支撐。基本的思路與技術(shù)方案見圖2。

圖1 發(fā)光細菌發(fā)光的代謝過程及原理圖[6,9]

圖2 中藥注射劑毒性快速評價關(guān)鍵技術(shù)研究技術(shù)路線圖

2.1 質(zhì)量控制

魚腥草注射液在臨床上應(yīng)用已有幾十年，詳見《全國中醫(yī)醫(yī)院急診科（室）必備中成藥》。其不良反應(yīng)存在多發(fā)、臨床表現(xiàn)的多樣、不可預(yù)知、不良反應(yīng)種類的不確定、批與批之間不良反應(yīng)存在差異性等特點。過敏反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)反應(yīng)、心腦血管系統(tǒng)反應(yīng)的構(gòu)成比依次排在魚腥草注射液不良反應(yīng)的前3位。CFDA暫停魚腥草靜脈注射液的使用，只批準肌內(nèi)注射劑使用，并要求進行魚腥草注射液（靜脈注射）安全性再評價。魚腥草注射液需要解決的關(guān)鍵問題包括：不良反應(yīng)的產(chǎn)生原因、發(fā)生機制、可否通過干預(yù)措施避免等方面尚不明確。本團隊以費氏弧菌作為測試菌種，探索將Microtox技術(shù)應(yīng)用于魚腥草注射液綜合毒性檢測。通過方法學(xué)考察確定最優(yōu)檢測體系以及方法可靠性，在最優(yōu)檢測體系下，對3個批次魚腥草注射液（成品），3個批次魚腥草注射液（半成品）以及2個批次魚腥草注射液（溶媒）進行生物綜合毒性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最優(yōu)檢測時間為15 min，最優(yōu)pH值是5.0-9.0，且15 min發(fā)光強度以500-1 000為宜；重復(fù)性試驗和中間精密度試驗的相對偏差均＜15%；成品的EC50值分別為51.62%、48.26%、41.69%，半成品的EC50值分別為57.64%、54.26%、57.04%，顯示魚腥草注射液半成品的綜合毒性均不同程度地小于魚腥草注射液成品的生物毒性；溶媒100%濃度（同注射液中溶媒濃度，即2.5‰的吐溫80溶液）的抑制率分別為12.29%和7.97%，顯示生物毒性均較小，幾乎可認為無毒。故認為魚腥草注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，故應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測魚腥草注射液綜合毒性并用于控制其質(zhì)量具有很好的應(yīng)用前景[17,18]。

2.2 風(fēng)險預(yù)警

紅花注射液臨床不良反應(yīng)原因、機制相對明確，抗原活性雜質(zhì)（蛋白）過敏反應(yīng)，但無法用現(xiàn)有檢驗方法發(fā)現(xiàn)和預(yù)警。紅花注射液有多個批次在全國部分地區(qū)出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)為主的不良反應(yīng)。經(jīng)調(diào)查，不良反應(yīng)的批號是同一批原料，在這批原料的前后，生產(chǎn)的產(chǎn)品都沒有不良反應(yīng)發(fā)生。產(chǎn)品經(jīng)檢驗，符合紅花注射液質(zhì)量標準。經(jīng)3個省藥檢所按質(zhì)量標準檢驗也是合格的。我們的目的是探討Microtox技術(shù)用于紅花注射液質(zhì)量控制，是否不良反應(yīng)風(fēng)險信號能在實驗室得到預(yù)警？本團隊以費氏弧菌為測試菌種，通過方法學(xué)考察確定最優(yōu)檢測體系及方法學(xué)可靠性；在最優(yōu)檢測體系條件下，對不同生產(chǎn)廠家所生產(chǎn)的紅花注射液進行發(fā)光菌綜合毒性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2 mL反應(yīng)體系下，最優(yōu)復(fù)蘇液體積0.9 mL/支菌，每個待測樣品加入最優(yōu)菌液體積50 μL，最優(yōu)檢測時間10 min，最優(yōu)pH范圍5-10，且10 min時發(fā)光強度以80-120萬為宜；重復(fù)性試驗、中間精密度試驗的相對標準偏差均＜15%；不同生產(chǎn)廠家A、B、C成品的EC50平均值分別為3.36%、5.58%、4.33%，具有顯著性差異（P＜0.05）。故得出紅花注射液對費氏弧菌的毒性存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，且不同生產(chǎn)廠家（包括原研單位在內(nèi)）之間成品EC50值具有顯著性差異，提示紅花注射液成品生物學(xué)檢測標準存在進一步提升的空間，應(yīng)用Microtox技術(shù)檢測紅花注射液綜合毒性并用于控制不同廠家成品質(zhì)量波動具有很好的應(yīng)用前景[19]。類似的結(jié)論在參麥注射液綜合毒性檢測、生脈注射液綜合毒性檢測均得到驗證。

3 總結(jié)與展望

目前，物質(zhì)毒性的常規(guī)檢測對綜合毒性的考慮較少，多以理化指標檢測為主，而要明確對人類健康的影響，則必須用生物醫(yī)學(xué)的方法對毒性進行分析，而傳統(tǒng)的毒理學(xué)實驗是以受試物的死亡進行判斷，一般需要數(shù)天時間才會出結(jié)果，而且影響因素多、個體差異大，以致動物消耗量過多、測試結(jié)果在不同實驗室波動較大。

3.1 Microtox技術(shù)特點

Microtox技術(shù)應(yīng)用于中藥注射劑綜合毒性的檢測具有以下6個特點：①發(fā)光細菌與高等動物的物化特性和酶作用過程類似，凡能干擾或破壞發(fā)光細菌生長、呼吸、新陳代謝等生理生化過程的物質(zhì)等都可以采用該方法進行生物毒性檢測，故是一種綜合毒性檢測方法[20,21]；②方法國際公認，可靠、客觀、快速，操作簡單方便，結(jié)果重復(fù)性好；③對毒物反應(yīng)靈敏，比一般細胞反應(yīng)靈敏幾個數(shù)量級；④試驗所用的細菌數(shù)量大，多達數(shù)百萬個，幾乎可以忽略各體差異；⑤可以同時獲得多個毒性參數(shù)，如：標準毒物參比值、IC50、毒性劑量-效應(yīng)動力學(xué)曲線等，既可以作為受試品毒效生物指紋圖譜，又可以測試其毒性效能和效強，綜合表征藥物毒性特點；⑥特別適用中藥注射劑、有毒中藥[22,23]以及藥物聯(lián)合毒性作用的快速評價[5]。

3.2 中藥注射劑現(xiàn)狀

近5年來，中藥注射劑的復(fù)合增長率約為22.00%，與之前30.00%的增長速度相比雖有所下降，但仍然高于中成藥和整個藥品市場的收入增長速度（分別為15.78%、18.23%）。目前，中國有303個企業(yè)具有134個中藥注射劑品種1 255個不同劑型規(guī)格的生產(chǎn)批文，其中常用品種有50多個。近年來隨著中藥注射劑臨床應(yīng)用的日益增加，不良反應(yīng)發(fā)生也日趨增多。從2006年“魚腥草事件”、“葛根素事件”到2008年的“茵梔黃事件”、“刺五加事件”，再到2009年的“清開靈事件”和“雙黃連事件”，讓中藥注射劑行業(yè)陷入了信任危機。2006年后，國家對中藥注射劑安全問題的關(guān)注達到了前所未有的高度。2009年7月，CFDA為切實控制中藥注射劑安全隱患，下發(fā)了《關(guān)于做好中藥注射劑安全再評價工作的通知》，全面開展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險排查工作。目前，中藥注射劑質(zhì)量控制檢測的項目包括：鑒別、性狀、重金屬、pH值、有關(guān)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹酯、草酸鹽、鉀離子）、灼熾殘渣、熱原或細菌內(nèi)毒素、裝量、無菌、不溶性微粒、含量測定、可見異物、降壓物質(zhì)、過敏反應(yīng)檢查、異常毒性、溶血與凝聚、有害元素、滲透壓、聚山梨酯80、指紋圖譜、5-HMF、大分子蛋白檢查等。然而，這些檢測項目仍然與有效保證其藥效的一致性和降低其不良反應(yīng)的發(fā)生率的目標有較大距離。

3.3 Microtox 技術(shù)應(yīng)用于中藥注射劑的前景展望

一般認為，中藥注射劑臨床不良反應(yīng)主要歸結(jié)為藥物過敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)，其臨床前致敏性的有效預(yù)測和致敏原控制的關(guān)鍵技術(shù)尚未得到解決。趙軍寧團隊認為，中藥成分的復(fù)雜性、易變性和現(xiàn)時人們對其認知的程度決定了中藥注射劑安全性問題是“綜合毒性”問題，具有多成分、多靶點、多途徑、低劑量、長時間、微毒性、綜合毒的作用特征。可以說，以復(fù)方或者混合物入藥的中藥，大多具有典型的“微小毒性”和“綜合毒性”特征，有必要發(fā)展新的、能有效預(yù)測和監(jiān)控復(fù)雜中藥的綜合毒性的評價技術(shù)。趙軍寧等[13,14]提出一種基于Microtox測試技術(shù)的快速檢測中藥注射劑綜合毒性的生物測試方法。紅花注射液、魚腥草注射液等的試驗數(shù)據(jù)，表明對于用傳統(tǒng)方法檢測合格的中藥注射液，該發(fā)明方法可以測出其毒性差異，可以較好地解釋現(xiàn)有中藥注射液不良反應(yīng)不一致的現(xiàn)象。由此可見，中藥注射劑綜合毒性快速檢測技術(shù)，即Microtox技術(shù)具有操作簡單、檢測速度快、準確度高、反應(yīng)靈敏等特點，可以檢測中藥注射液毒性的大小，亦可作為中藥注射液質(zhì)量控制的生物評價依據(jù)。在某些品種可采用Microtox技術(shù)，建立采用生物活性限值測定法（制定中藥注射液對發(fā)光菌IC50生物限值），可以很好地預(yù)警在臨床應(yīng)用可能發(fā)生的不良反應(yīng)。

目前該技術(shù)在中藥及中藥注射劑應(yīng)用剛開始起步，尚不能完全區(qū)分中藥的內(nèi)在活性和外源性的毒性，可嘗試開展該技術(shù)用于區(qū)分毒性物質(zhì)和特異性毒性的研究，有必要擴大樣本量、擴大研究范圍、多部門跨領(lǐng)域多學(xué)科合作研究，對該技術(shù)進行更深入的研究，并探討該技術(shù)評價結(jié)果與其他毒性評價方法及臨床不良反應(yīng)監(jiān)測結(jié)果的一致性和關(guān)聯(lián)性，基于Microtox技術(shù)的中藥注射劑質(zhì)量控制方法的標化與技術(shù)指導(dǎo)原則，適用于中藥特點的定性定量參數(shù)表述；生物效價測定法和生物活性限值測定法的研究和完善，藥品評價專用儀器開發(fā)等都是下一步需要解決的問題。2014年2月，由國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心組織邀請全國藥理毒理、藥品檢驗、中藥制劑、藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域的專家參會，討論基于Microtox技術(shù)的中藥綜合毒性快速評價技術(shù)在中藥注射劑中應(yīng)用的可行性及推廣前景，專家一致認為 Microtox技術(shù)在中藥質(zhì)量預(yù)警、毒性快速檢測、質(zhì)量評價等方面有較高的應(yīng)用價值，值得進一步深入研究。進一步完善專門針對中藥的Microtox技術(shù)體系，完成標準化檢測，將可能是復(fù)雜成分中藥質(zhì)量控制、毒性快速檢測、以及風(fēng)險預(yù)警的重大突破。

致謝：本研究思路和方法的完善，得益于國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心杜曉曦主任和宋海波博士等的大力支持以及參加“基于Microtox（微毒測試）的中藥綜合毒性快速評價技術(shù)專家研討會”各位專家的精彩發(fā)言，在此一并致以最誠摯的謝意！

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A Quick Evaluation of Comprehensive Toxicity of Traditional Chinese Medical Injections Based on Microtox Technology

Zhao Junning1, Yan Liangchun1, Luo Limin2
(1. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China; 2. China Resources 999 Pharmaceutical Co., Ltd. (Ya'an), Ya'an 625000, China)

Microtox technology is one of quick toxicity test methods for determining the poisonous or toxic substances in the environment by luminous bacteria as a indicator organism. This paper reviewed the appearance and development of microtox technology. Besides, we expounded the methods and stepwise technique map and addressed key questions of microtox technology for the evaluation of the comprehensive toxicity of Chinese medicinal materials. In conclusion, microtox technology is a promising method from a vantage point of the toxicity detection of Chinese medicinal materials.

Traditional Chinese medical injections, microtox technology, luminous bacteria, toxicity, biological evaluation

10.11842/wst.2016.11.015

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-15

修回日期：2016-11-20

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃“973計劃”（2009CB522801）：有毒中藥毒效學(xué)和靶器官毒作用規(guī)律研究，負責(zé)人：趙軍寧；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）測試的中藥安全性快速檢測、質(zhì)量控制與風(fēng)險預(yù)警新技術(shù)研究，負責(zé)人：趙軍寧；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（2011ZX09401-304）：成都生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新孵化基地，負責(zé)人：趙軍寧；科學(xué)技術(shù)部國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B10）：川產(chǎn)道地藥材整合式全產(chǎn)業(yè)鏈技術(shù)集成與示范，負責(zé)人：趙軍寧；國家自然科學(xué)基金委面上項目（81470180）：基于Microtox技術(shù)的中藥毒性分級原理與標準研究，負責(zé)人：趙軍寧；四川省科學(xué)技術(shù)廳科技支撐計劃項目（2014SZ0135）：姜黃整合式全產(chǎn)業(yè)鏈綜合開發(fā)研究，負責(zé)人：曾瑾。

＊＊ 通訊作者：趙軍寧，本刊編委，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥理（毒理）、中藥質(zhì)量生物控制、道地藥材系統(tǒng)研究開發(fā)。