易 誠(chéng)，陳 敏，黃 麗，龍九妹

(衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008)

酸法提取活性污泥中生物絮凝劑及其成分研究

易 誠(chéng)，陳 敏，黃 麗，龍九妹

(衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008)

為尋找適合于二次流混凝沉降好氧顆粒污泥的培養(yǎng)的生物絮凝劑，以污水處理廠二沉池污泥為原材料，利用鹽酸提取其中生物絮凝劑。結(jié)果表明：以18 %的鹽酸溶液提取，污泥量為100 mL時(shí)、添加鹽酸15 mL，攪拌速度700 r/min，提取時(shí)間為15 min，提取率達(dá)4.11 %，經(jīng)檢測(cè)其多糖含量為23.10 %(w/w)，蛋白質(zhì)含量為29.83 %(w/w)。

生物絮凝劑；污泥；鹽酸提取法

絮凝技術(shù)作為一種重要的水體凈化技術(shù)，有著廣泛的應(yīng)用，但是近年來(lái)因化學(xué)絮凝劑的大量使用而帶來(lái)的環(huán)境及人體健康問(wèn)題，使得新型絮凝劑的制備、選擇及應(yīng)用研究越來(lái)越受到重視。生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的，可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒凝聚、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物[1]。生物絮凝劑具有絮凝沉降效果好，因其可生物降解性，安全無(wú)毒、不造成二次污染，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多的關(guān)注。但微生物生培養(yǎng)條件苛刻，制備成本高，如何降低成本？從活性污泥中提取生物絮凝劑[2]應(yīng)該是最理想的方法，一方面可以解決剩余生物污泥對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞和人類活動(dòng)構(gòu)成威脅，另一方面還能合理利用污泥中的有效成分，避免資源浪費(fèi)，大大降低生物絮凝劑的生產(chǎn)成本[3-7]。

本文選用鹽酸提取法提取活性污泥中的生物絮凝劑[6]，為提高提取效果，對(duì)酸提取法的條件進(jìn)行正交優(yōu)化，對(duì)得到的生物絮凝劑進(jìn)行蛋白質(zhì)及多糖含量進(jìn)行分析，并通過(guò)提純得到純生物絮凝劑,為二次流混凝沉降好氧顆粒污泥的培養(yǎng)提供良好的絮凝劑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供實(shí)驗(yàn)材料采自衡陽(yáng)市城西污水處理廠的剩余污泥，污泥置于室溫下靜置8-24 h后傾去上清液，得到的重力濃縮污泥，其濃度為：15.0-22.0 g/l，VSS/SS為60.0 %-80.0 %，pH值為：6.0-7.5。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸、氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)G250、苯酚、葡萄糖、濃硫酸等均為分析純

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TGL-16C高速離心機(jī)，上海飄深機(jī)械有限公司；SH05-3T恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；JA2603B電子天平，上海衡祥電子衡器有限公司；722型可見分光光度計(jì)，寧波力勝儀器有限公司；DGG9030A鼓風(fēng)烘箱，上海島韓實(shí)業(yè)有限公司。計(jì)時(shí)器、過(guò)濾裝置、燒杯、錐形瓶、試管、玻璃棒、量筒、移液管等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸法提取條件的確定

以剩余污泥為原料，利用酸提取法進(jìn)行生物絮凝劑的提取，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]及初步實(shí)驗(yàn)，取自由沉降24 h的活性污泥 100 mL(濃度為21.58 g/l)，加入10 mL、18 %的鹽酸溶液，將其攪拌700 r/min，提取時(shí)間為10 min, 提取后取懸濁液離心10 min(8 000 r/min),離心的上層清液即為水提取的粗絮凝劑，經(jīng)提取和提純[9]，提取率為3.40 %，正交實(shí)驗(yàn)以此為基數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

1.2.2 絮凝劑中多糖測(cè)定[3]

多糖在濃硫酸的作用下，水解生成單糖，之后迅速脫水生成糖醛衍生物，該類衍生物可與苯酚縮合生成有色化合物，再用分光光度法測(cè)定。

最大吸收波長(zhǎng)選擇：吸取0.04 mg/mL，無(wú)水葡萄糖溶液1.00 mL，置10.0 mL具塞試管中，去離子水稀釋至2.0 mL，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加98 %(w/w)濃硫酸5.0 mL，在水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。以去離子水代替糖溶液如上述方法配制空白。用分光光度計(jì)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)在490±5 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取0.01 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分置于10 mL具塞試管中，加入去離子水稀釋至2.0 mL，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，置于沸水水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。以蒸餾水代替糖溶液如上述方法配制空白。用分光光度計(jì)在490 nm測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖濃度—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 絮凝劑中蛋白含量測(cè)定

蛋白質(zhì)分子具有酰胺基團(tuán)，棕紅色的考馬斯亮藍(lán)-G250染料上的陰離子可以與蛋白質(zhì)上的酰胺基結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色。其最大吸收峰位置由465 nm變到595 nm，此時(shí)蛋白質(zhì)與染料結(jié)合物在此波長(zhǎng)下的吸光度值與蛋白質(zhì)含量成正比。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精確稱取牛血清蛋白12.800 0 mg，用少量蒸餾水溶解定容至100.00 mL，即為0.10 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，置于冰箱中保存。

考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備：精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，加入95 %乙醇50.0 mL，再加入85 %磷酸100.0 mL,最后用蒸餾水定容至1 000.00 mL。置于棕色容量瓶中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于10 mL具塞試管中，各管加水至1.0 mL。加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL，搖勻，放置10 min，于595 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.4 生物絮凝劑的提純

將最佳條件下提取的絮凝劑劑液用孔徑為3 um的慢速濾紙過(guò)濾，并將過(guò)濾后的清液稀釋到150 mL。并用4 %(w/w)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)粗絮凝劑溶液的pH值到9.0，其中有大量的沉淀生成，再向其加入200 mL的95 %乙醇靜置15 min,離心分離(8 000 r/min)，取固體加入10.0 mL去離子水，攪拌(440 r/min)均勻，將濁液置于截留分子量為10 000Da透析袋中以流動(dòng)的去離子水透析24 h。離心分離(8 000 r/min)透析后的濁液，取固體置于40 ℃下干燥。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸提法最佳提取條件的確定

根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取鹽酸用量、提取時(shí)間、攪拌速度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)L9(3)4，以提取和提純后的量為參照，參數(shù)設(shè)計(jì)見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)分析表

從表1、表2中可以看出，對(duì)活性污泥中生物絮凝劑提取的試驗(yàn)中因素影響順序?yàn)锳>B>C，添加鹽酸的量為最大影響因素，其次是提取時(shí)間，而轉(zhuǎn)速影響最小，試驗(yàn)中最高提取率達(dá)4.03 %，通過(guò)分析其最佳組合A3B3C2，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明其提取率為4.11 %，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件為A3B3C2。微生物產(chǎn)生的絮凝劑物質(zhì)為糖蛋白、粘多糖、蛋白質(zhì)、纖維素、DNA等高分子化合物，在酸性條件下，有利于蛋白質(zhì)等物質(zhì)的變性離析，添加酸量對(duì)蛋白質(zhì)的影響明顯不同。同時(shí)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，提取時(shí)間對(duì)提到率有較大的影響，說(shuō)明在提取過(guò)程中，除蛋白質(zhì)變性離析以外，多糖類物質(zhì)酸解后的溶解隨時(shí)間而增加。在攪拌轉(zhuǎn)速中，一則可能取值遞度過(guò)少，二則可能最低轉(zhuǎn)速過(guò)大，以至于轉(zhuǎn)速對(duì)提取的影響不是明顯

2.2 生物絮凝劑的成分分析[10]

2.2.1 污泥生物絮凝劑的多糖成分分析結(jié)果

2.2.1.1 多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.3絮凝劑中多糖測(cè)定中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟，得出多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1.2 絮凝劑中多糖測(cè)定

取分離出來(lái)的絮凝劑2.0 mL置于10 mL具塞試管中，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，置于沸水水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室——用分光光度計(jì)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)在490 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定出絮凝劑中多糖的含量(見表3)。

表3 絮凝劑中多糖的含量

從表3可以看出，絮凝劑中多糖最高含量近27.14 %，最小為18.46 %，平均含量為23.10 %(w/w)。

2.2.2 污泥生物絮凝劑的蛋白質(zhì)成分分析

根據(jù)1.2.3中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法得出蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2

取絮凝劑提取液各1.0 mL入10 mL具塞試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL，搖勻，放置10 min，于595 nm處測(cè)定其吸光度。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定出絮凝劑中蛋白質(zhì)的含量(見表4)

圖2 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗(yàn)號(hào)123456789絮凝劑提取量/mg74.2477.2682.0077.2680.9383.7375.9686.9785.46蛋白質(zhì)/mg21.1520.7724.4422.8424.9024.8721.5928.9926.96占絮凝劑比例/%28.4926.8829.8029.5730.7729.7028.4233.3331.55

從表4中可以看出，絮凝劑中蛋白質(zhì)的含量最高為33.33 %，最低為0.88 %，平均含量為29.83 %(w/w)

3 結(jié) 論

以污水處理廠二沉池污泥為原材料，以18 %的鹽酸作為提取劑所，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定提取污泥的量、鹽酸添加量、離心轉(zhuǎn)速和提取時(shí)間等因素，表明提取時(shí)間為最大影響因素，其次是鹽酸的添加量，確定以100 mL的污泥量，15毫升的18 %鹽酸，攪拌速度700 r/min，提取時(shí)間為15分鐘條件下的生物絮凝劑的提取率為4.11 %。通過(guò)硫酸苯酚法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得多糖含量23.10 %(w/w)，蛋白質(zhì)含量為29.83 %(w/w)。

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(編校 陳志陽(yáng))

On Bio-flocculant Extraction By Acid Method from Activated Sludge and Its Components

YICheng,CHENMin,HUANGLi,LONGJiu-mei

(College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang Hunan 421008,China)

In order to find suitable biological flocculant for aerobic granular sludge with second flow mixed culture coagulation,with the sludge in secondary sedimentation as raw material,extracting the biological flocculant with hydrochloric acid.Results show that: extracted with 18 % hydrochloric acid solution,when sludge was 100 mL,adding amount of hydrochloric acid was 15 mL,stirring speed was 700 rpm,extraction time was 15 min,the extraction rate was 4.11 %,at last there were 23.10 % polysaccharide (w/w) and 29.83 % protein (w/w) in it with detection.

biological flocculant; sludge; hydrochloric acid extraction method

2016-10-08

湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2018)

易誠(chéng)(1970-)，男，湖南衡陽(yáng)人,教授,博士, 研究方向:水污染控制。

Q179.1

A

1673-0313(2016)06-0093-04