何薇 吳菁 盧建 尹愛(ài)華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

探討染色體微陣列分析在無(wú)明顯表型異常成年人中的臨床應(yīng)用

何薇 吳菁 盧建 尹愛(ài)華*

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

目的 探討染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)在無(wú)明顯表型異常成年人中的臨床應(yīng)用。方法 選取2014年1月至2016年5月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行的，無(wú)明顯表型異常成人外周血CMA病例，共計(jì)136例進(jìn)行回顧性分析,所有病例均進(jìn)行了染色體G顯帶核型分析及CMA檢測(cè)。結(jié)果 33例因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽(yáng)性進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性有10例，占總病例的30.3%，占家庭數(shù)的52.6%；76例因不良生育史進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性有9例，占總病例的11.8%，占家庭數(shù)的16%；25例因夫婦一方染色體異常進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性有3例，占總病例的12%；2例因特殊家族史進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)的，外周血CMA均未見(jiàn)明顯異常。結(jié)論 對(duì)于無(wú)明顯表型異常的成年群體可以有針對(duì)性地選擇CMA檢測(cè)，可以明確其遺傳學(xué)病因，從而提供更全面詳細(xì)的細(xì)胞遺傳學(xué)信息及遺傳咨詢。

無(wú)表型異常成年人；染色體微陣列分析技術(shù)；染色體核型分析

染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis, CMA)代表所有以微陣列為技術(shù)基礎(chǔ)的基因組拷貝數(shù)分析技術(shù)，包括基于比較基因組雜交的微陣列( array-based comparative genomic hybridization，aCGH)和基于單核苷酸多態(tài)性的微陣列( single nucleotide polymorphism arrays，SNP arrays)。染色體微陣列技術(shù)有高分辨率、高敏感性、高通量、快速準(zhǔn)確、易于自動(dòng)化、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，基于以上這些優(yōu)點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，特別是對(duì)產(chǎn)前遺傳性疾病的診斷[1-5]。

對(duì)于超聲異常胎兒孕期產(chǎn)前診斷首選CMA，美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)(ACOG)和母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(SMFM)提供的指南中指出，對(duì)于只要了解介入性產(chǎn)前診斷風(fēng)險(xiǎn)、CMA檢測(cè)意義及局限性者，產(chǎn)前超聲沒(méi)有任何異常也可進(jìn)行胎兒CMA檢查[6]。無(wú)明顯表型異常的成人，并不代表CMA檢測(cè)結(jié)果無(wú)異常，即便是檢測(cè)出特定疾病，其在不同患者間臨床表現(xiàn)可能存很大變異以及對(duì)后代的影響不盡相同，原因可能與累及基因的表現(xiàn)度和外顯率不同有關(guān)，因此CMA檢測(cè)在該類群體中有一定的意義。目前暫無(wú)指南對(duì)無(wú)明顯表型異常的成人群體提供明確指導(dǎo)性的檢測(cè)建議，本文章旨在通過(guò)回顧性分析本中心在2014年1月至2016年5月無(wú)明顯表型異常成人外周血CMA病例，探討CMA在無(wú)明顯表型異常成年人群中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 分析2014年1月至2016年5月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，且年齡≥18歲以上的病例，年齡在18～57歲，平均(29.57±5.96)歲，共計(jì)136例，包括33例產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽(yáng)性，76例不良生育史，25例因夫婦一方染色體異常及2例特殊家族史進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取靜脈血5ml，所有標(biāo)本均進(jìn)行染色體核型分析及CMA檢測(cè)。

1.2.2 染色體核型分析 對(duì)外周血標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)制片、G顯帶分析，顯微鏡下檢查20個(gè)核型，分析3個(gè)核型，若出現(xiàn)嵌合體則檢查50個(gè)或100個(gè)核型。

1.2.3 CMA檢測(cè) 本中心在2016年4月之前，采用Agilent公司生產(chǎn)的8×60k芯片進(jìn)行全基因組掃描檢測(cè)，自2016年4月開(kāi)始，采用美國(guó)Affymetric公司提供的高分辨率全基因組Cytoscan 750K芯片對(duì)全基因組已知基因區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析，Affymetric平臺(tái)不僅能檢測(cè)基因組缺失、重復(fù)，還能檢測(cè)雜合性缺失和單親二體。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照各個(gè)公司提供的操作流程。

1.3 數(shù)據(jù)分析 分析過(guò)程分別參照本中心內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)以及在線公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，如DGV數(shù)據(jù)庫(kù)、DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)等。

2 結(jié)果

2.1 排除11例表型異常病例，對(duì)136例無(wú)明顯表型異常者外周血CMA檢測(cè)的病例匯總分析，具體見(jiàn)表1。

表1 136例無(wú)明顯表型異常成人外周血CMA檢測(cè)結(jié)果

注：*夫婦對(duì)數(shù)，若夫婦雙方都進(jìn)行CMA檢測(cè)，算一對(duì)夫婦，例數(shù)算2例；§百分率，括號(hào)中有兩個(gè)數(shù)值，第一個(gè)數(shù)值的是陽(yáng)性病例數(shù)的百分率，第二個(gè)數(shù)值是陽(yáng)性家庭數(shù)(一對(duì)夫婦算一個(gè)家庭)的百分率

2.2 2 2例外周血CMA檢測(cè)陽(yáng)性病例結(jié)果匯總分析，具體見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 CMA檢測(cè)結(jié)果分析 33例因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽(yáng)性進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，其中包括14對(duì)夫婦，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果有10例陽(yáng)性，占總病例的30.3%，占家庭數(shù)(雙親同時(shí)做則算一個(gè)家庭)的52.6%，遺傳自雙親的10例，除case1(在孕20+周，超聲提示胎兒骨骼發(fā)育異常：胸廓狹窄、四肢長(zhǎng)骨短小、雙足內(nèi)翻、頸段及骶尾段椎體異常)、case2、case5和case7選擇終止妊娠，其余6例均選擇繼續(xù)妊娠。4例NT增厚病例，NT厚度分別為3.6mm、2.7mm、2.6mm和3.0mm，根據(jù)本中心總結(jié)NT數(shù)值與產(chǎn)前診斷陽(yáng)性例數(shù)相關(guān)性及國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)[7,8]，現(xiàn)已將NT≥3.0mm定義為NT增厚，尤其對(duì)于NT≥3.5mm者，更應(yīng)建議選擇介入性產(chǎn)前診斷，排除胎兒染色體異常。有4例22q11微重復(fù)綜合征，均在雙親中找到了遺傳來(lái)源，雙親攜帶者均無(wú)明顯異常。

表2 22例外周血CMA陽(yáng)性病例

注：*外周血染色體G顯帶結(jié)果；§外周血CMA結(jié)果

76例因不良生育史進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，其中包括22對(duì)夫婦，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果有9例陽(yáng)性，占總病例的11.8%，占家庭數(shù)的16%。該組病例有些是因?yàn)榧韧衅诎l(fā)現(xiàn)胎兒超聲異常，進(jìn)行了胎兒CMA檢測(cè)，但夫婦雙方拒絕CMA檢測(cè)，對(duì)于不明原因的CNV無(wú)法判斷來(lái)源及胎兒預(yù)后，選擇終止妊娠為結(jié)局，當(dāng)再次備孕或妊娠時(shí)，在孕前或孕期選擇性的進(jìn)行夫婦雙方或一方外周血CMA檢測(cè)。9例陽(yáng)性病例均同既往引產(chǎn)胎兒染色體微缺失或微重復(fù)一致。建議在產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)CNV時(shí)，胎兒雙親應(yīng)及時(shí)進(jìn)行CMA檢測(cè)，雖然目前發(fā)現(xiàn)一些CNV在父母身上表型是正常的，下一代身上表型是異常的[9]，但進(jìn)行胎兒雙親CMA檢測(cè)，仍然可對(duì)胎兒預(yù)后的評(píng)估起到不可替代的意義。Case9，患者本人既往史無(wú)特殊，無(wú)明顯表型異常，G3P0，自然流產(chǎn)3次，其中2次流產(chǎn)物FISH均提示8號(hào)三體，外周血染色體G顯帶核型分析提示：46,XX,9qh+,16qh+,外周血CMA檢測(cè)結(jié)果提示：X染色體X22.31位置發(fā)生重復(fù)，片段大小約1.5Mb。該重復(fù)區(qū)域包含HDHD1A、STS、VCX、PNPLA4基因，其中STS基因的純合性缺失可導(dǎo)致X連鎖魚(yú)鱗病，但該區(qū)域的重復(fù)是否致病尚存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為與發(fā)育遲緩、癲癇等有關(guān)，亦有學(xué)者認(rèn)為可能是良性變異，因此該CNV的臨床意義不明，建議下次孕期行產(chǎn)前診斷。

25例因夫婦一方染色體異常進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)，外周血CMA檢測(cè)結(jié)果有3例陽(yáng)性，占總病例的12%。值得說(shuō)明的，染色體G顯帶對(duì)CMA檢測(cè)是有效補(bǔ)充，特別在染色體提示數(shù)目異常，結(jié)構(gòu)異常等情況下。因此，在條件允許情況下，盡量選擇染色體G顯帶及CMA同時(shí)檢測(cè)。該25例夫婦一方染色體異常，均不屬于染色體數(shù)目異常，其中2例是嵌合體，23例是無(wú)法確認(rèn)異常片段的來(lái)源和性質(zhì)。Case1外周血CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)15號(hào)染色體15q11.1-q11.2發(fā)生重復(fù)，增加了2個(gè)拷貝，提示marker染色體可能來(lái)源于15號(hào)染色體，目前尚無(wú)證據(jù)表明該區(qū)域重復(fù)可以致病。

2例因特殊家族史進(jìn)行外周血CMA檢測(cè)的，均是家族中有2名或2名以上先天性智障者，其外周血CMA未見(jiàn)明顯異常。

在2014年1月至2016年5月期間，有11例成年表觀異常者選擇外周血CMA檢測(cè)，共有2例陽(yáng)性，占總病例數(shù)的18.1%。與其他幾組數(shù)據(jù)比較，除“因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽(yáng)性”組(30.3%，52.6%)，成年表觀異常組的CMA陽(yáng)性率均較其他幾組高。在歐美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家CMA檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于智力障礙、兒童早期發(fā)育遲緩、新生兒出生缺陷、孤獨(dú)癥譜系障礙等[10,11]，CMA檢測(cè)應(yīng)用于表型異常者，即應(yīng)用于先證者時(shí)陽(yáng)性檢出率明顯增加。在遺傳咨詢時(shí)，若家族中存在先證者，應(yīng)建議先證者先進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，咨詢者再相應(yīng)的選擇檢查項(xiàng)目。

3.2 CMA檢測(cè)的局限性 CMA是一種基于基因芯片技術(shù)的染色體病診斷方法，可以檢測(cè)染色體核型分析不能診斷的小片段缺失或重復(fù)(限于所選平臺(tái)檢測(cè)范圍內(nèi)的)，但是無(wú)法檢出染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位)、倒位等不存在片段缺失或重復(fù)的染色體結(jié)構(gòu)異常、也不適合檢測(cè)染色體多倍體(如三倍體、四倍體)、異常比率較低(≤20%)的嵌合體以及其他拷貝數(shù)沒(méi)有變化的染色體畸變、基因重組和點(diǎn)突變則無(wú)法檢測(cè)。單獨(dú)選擇CMA，不進(jìn)行外周血染體G顯帶檢測(cè)時(shí)會(huì)遺漏部分染色體結(jié)果異常的病例。

CMA能夠在全基因組水平進(jìn)行掃描，可檢測(cè)染色體不平衡的拷貝數(shù)變異 (copy number variant, CNV)尤其是對(duì)于檢測(cè)染色體組微小缺失、重復(fù)等不平衡性具有突出優(yōu)勢(shì)。因 CMA 得到的檢測(cè)結(jié)果信息量大，健康個(gè)體普遍存在拷貝數(shù)多態(tài)性，需要結(jié)合 CNV 片段的大小、位置和基因含量，并查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)判斷 CNV 的性質(zhì)。按照指引的分類[12,13]，CNV可分為致病CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV(variants of unknown significance，VOUS)、可能良性CNV和良性CNV，焦點(diǎn)在“VOUS”，值得探討的在“可能致病的CNV、可能良性的CNV”。VOUS其中部分情況是罕見(jiàn)的新生突變，部分與突變基因的外顯率有關(guān)，即胎兒有罹患某種遺傳病的易感性，但并不一定發(fā)病。一些CMA陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)現(xiàn)不能確定其是否有臨床價(jià)值，需要對(duì)先證者雙親進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)來(lái)協(xié)助判斷，如因“產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽(yáng)性”組，有10例CMA陽(yáng)性，在先證者雙親中的一方外周血CMA檢查結(jié)果中發(fā)現(xiàn)與胎兒類似CNV，說(shuō)明該CNV為家族性變異。很多良性或者致病 CNV 雖已被證實(shí)，但由于表達(dá)的不穩(wěn)定性和個(gè)體差異不完全的外顯率，很多檢測(cè)結(jié)果仍然不能被準(zhǔn)確的解釋。

3.3 CMA檢測(cè)的遺傳咨詢 隨著科技的發(fā)展，越來(lái)越多的分子遺傳學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)用于臨床，如一代測(cè)序、二代測(cè)序等，所有遺傳檢測(cè)項(xiàng)目都應(yīng)經(jīng)過(guò)有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估和咨詢，針對(duì)咨詢者的實(shí)際情況建議合適的檢查。CMA檢測(cè)亦是如此，在檢查前，應(yīng)充分告知檢測(cè)者該項(xiàng)檢查的范圍、意義和局限性，在解釋結(jié)果時(shí)，因很多基因變異的臨床意義尚未明確，檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)結(jié)論是基于目前科學(xué)研究和數(shù)據(jù)庫(kù)資料的基礎(chǔ)上而得到，必要時(shí)需雙親，甚至家族成員進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，應(yīng)充分解釋。

3.4 容易忽略的咨詢 CMA并不能檢出所有的CNV，CMA探針的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵基因區(qū)探針覆蓋，例如，1、9、16號(hào)及Y染色體次縊痕區(qū)域和D組、E組染色體短臂等區(qū)域，這些區(qū)域并未設(shè)置檢測(cè)探針，因此CMA檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)異常，實(shí)際表明沒(méi)有檢測(cè)出關(guān)鍵基因在200kb以上的缺失或重復(fù)；對(duì)于低于檢測(cè)分辨率的CNV也無(wú)法檢出；CMA無(wú)法檢測(cè)單基因遺傳病的點(diǎn)突變異常、基因表達(dá)異常和甲基化異常；此外，CMA檢測(cè)結(jié)果會(huì)帶有預(yù)測(cè)性質(zhì)的告知今后可能發(fā)生的疾病即成人期遲發(fā)型疾病，可能會(huì)帶來(lái)恐慌和家庭糾紛，因在選擇CMA檢測(cè)時(shí)應(yīng)充分告知，并使夫婦作出合理的決定；應(yīng)用不同的平臺(tái)及分辨芯片，針對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)有可能會(huì)出現(xiàn)差異性結(jié)果，這是由于檢測(cè)本身的技術(shù)特點(diǎn)所決定，而并非醫(yī)務(wù)人員造成誤診或漏診。

3.5 無(wú)明顯表型異常成人CMA檢測(cè)的適用 建議在有資質(zhì)及經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師咨詢后，充分了解CMA的意義、局限性及檢測(cè)費(fèi)用后，要求進(jìn)行CMA檢測(cè)者；胎兒產(chǎn)前診斷CMA報(bào)告提示意義床意義不明CNV(VOUS)、可能致病的CNV、可能良性CNV和良性CNV；子代發(fā)現(xiàn)外顯率低的復(fù)發(fā)性CNV；不良生育史者(如因超聲異常引產(chǎn)或生育異常患兒者)；存在染色體嵌合體或不明原因染色體者。

CMA 技術(shù)在分子遺傳學(xué)分析中有著顯著的優(yōu)越性，總結(jié)以上經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于無(wú)明顯表型異常的成年群體可以有針對(duì)性地選擇CMA 檢測(cè)以明確其遺傳學(xué)病因，從而提供科學(xué)的生育指導(dǎo)。隨著 CMA技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其檢測(cè)價(jià)格將會(huì)在一定程度上降低，相信 CMA 技術(shù)會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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編輯：宋文穎

Objective To evaluate the contribution of chromosome microarray analysis (CMA) in adults those who with no obvious phenotypic abnormalities. Method 136 no obvious phenotypic abnormality cases between January 2014 and May 2016 were retrospectively, at Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children’s Hospital, all of the cases were evaluated by the traditional karyotype and CMA. Results Fetal prenatal diagnosis CMA positive group have 33 cases,10 cases of peripheral blood CMA positive, accounting for 30.3% of the total cases,52.6% of the number of households; adverse reproductive history group have 76 cases, 9 cases of peripheral blood CMA positive , accounting for 11.8% of the total cases, 16% of the number of households; one of the couple chromosomal abnormalities group have 25 cases, 3 cases of peripheral blood CMA positive, accounting for 12% of the total cases; special family history group have 2 cases, peripheral blood CMA results were no significant abnormalities. Conclusions The application of CMA in adults with no obvious phenotypic abnormalities, can identify the etiology genetic, provide more comprehensive and detailed cytogenetic information and genetic counseling.

adults with no obvious phenotypic abnormalities；chromosome microarray analysis； karyotype

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.007

R714.55

A

2016-09-25)

DOI: 10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.008

*通訊作者：尹愛(ài)華，E-mail：yinaiwa@126.vip.com