侯志芳，雷秀娟，張艷敬，梁韶，王英平，鄭培和

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112)

人參(PanaxginsengC.A Meyer)屬五加科人參屬多年生宿根草本藥用植物，是聞名遐邇的“東北三寶”之一。在中國(guó)，人參歷來(lái)被視為百草之王。人參種質(zhì)資源是人參生產(chǎn)的源頭，是人參育種的原始材料，是人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。人參種質(zhì)資源的好壞直接決定了人參質(zhì)量的優(yōu)劣和產(chǎn)量的高低，因此，人參種質(zhì)資源的收集和保存至關(guān)重要。新形勢(shì)下，種質(zhì)資源圃是植物的主要保存方式，是植物種質(zhì)保存的主要場(chǎng)所[1]。種質(zhì)資源的鑒定也是種質(zhì)資源必不可少的內(nèi)容，分子標(biāo)記技術(shù)具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，有效彌補(bǔ)了多年生植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖難這一缺點(diǎn)，所以分子標(biāo)記技術(shù)可以作為人參種質(zhì)資源分析和鑒定的一種有效方法。

分子標(biāo)記通常指在生物個(gè)體或群體之間可遺傳并可檢測(cè)的具有差異的DNA序列，發(fā)展迅速，滲入到生物學(xué)科的各個(gè)領(lǐng)域，自20世紀(jì)80年代，AFLP作為研究生物遺傳多樣性的方法以來(lái)[2]，分子標(biāo)記技術(shù)備受研究者青睞。本文對(duì)近些年在人參種質(zhì)資源研究中應(yīng)用比較多的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random amplified polymorphic，RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)等6種分子標(biāo)記進(jìn)行總結(jié)和討論，為人參的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1　人參種質(zhì)資源的研究現(xiàn)狀

野生人參和栽培人參是人參種質(zhì)資源中最主要的兩大類型，其中野生人參為國(guó)家珍稀瀕危物種。近年來(lái)，由于人們保護(hù)不當(dāng)，人參種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞，栽培人參品質(zhì)下降、品種混亂，野生人參資源更是呈減少趨勢(shì)。因此，收集和整理人參種質(zhì)資源迫在眉睫，急需構(gòu)建人參種質(zhì)基因庫(kù)[3]。人參栽培歷史悠久，經(jīng)過(guò)不斷選擇和長(zhǎng)期進(jìn)化，栽培人參已形成長(zhǎng)脖參、石柱參、邊條參、大馬牙、園膀園蘆、二馬牙等不同的品種類型[4]，但這些大部分只是根據(jù)形態(tài)特征和栽培特點(diǎn)所命名，并沒(méi)有規(guī)范明確的命名依據(jù)。人參特有的生長(zhǎng)條件和較長(zhǎng)的生活周期等外界因素制約了其農(nóng)藝性狀特征的一致性，因此，在異地栽培條件下根據(jù)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別的難度也較大[5]，所以，僅僅靠形態(tài)學(xué)標(biāo)記不能滿足對(duì)人參種質(zhì)資源的收集、鑒別、保護(hù)和利用。

2　分子標(biāo)記技術(shù)在人參種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

2.1　RAPD分子標(biāo)記

RAPD分子標(biāo)記是Williams[6]和Welsh[7]于1990年首次報(bào)道的一種較為簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA多態(tài)性技術(shù)，該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，初期深受研究者喜愛(ài)。1997年，馮斗等[8]應(yīng)用RAPD方法首次獲得了人參的DNA特異性擴(kuò)增片段，對(duì)不同人參品種進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示了2種人參品種的特異性條帶，證實(shí)了RAPD方法應(yīng)用于人參鑒定是可行的。周桐[9]和許永華[10]分別優(yōu)化了人參基因組DNA的提取方法和RAPD-PCR反應(yīng)條件。結(jié)果表明，用改良的CTAB方法提取的DNA均達(dá)到了RAPD-PCR分析的要求。Erin M.Schlag等[11]使用RAPD標(biāo)記研究了西洋參品種間的遺傳多樣性。但由于RAPD標(biāo)記重復(fù)性差、擴(kuò)增條帶有限等缺點(diǎn)，近年來(lái)逐步被其他分子標(biāo)記技術(shù)所取代。

2.2　AFLP分子標(biāo)記

1993年，荷蘭Keygene公司的Zabeau和Vos 2位科學(xué)家提出了一種通過(guò)對(duì)基因組DNA進(jìn)行高通量分析的分子標(biāo)記技術(shù)[12]，即AFLP技術(shù)。該技術(shù)不僅能完成基因組DNA的高通量分析，而且還可以對(duì)全基因組多個(gè)遺傳變異位點(diǎn)進(jìn)行分析[13]，在基因流動(dòng)和遺傳變異等方面被廣泛應(yīng)用[14]。2000年，馬小軍等[15]應(yīng)用AFLP技術(shù)研究了5個(gè)農(nóng)家類型人參DNA，從其特定指紋中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)脖人參更接近野生人參，長(zhǎng)脖人參內(nèi)部有更多的雜合態(tài)個(gè)體，因此，長(zhǎng)脖人參的AFLP有相對(duì)較高的多態(tài)性。但由于該分子標(biāo)記受多因素影響且有操作復(fù)雜、反應(yīng)步驟多等缺點(diǎn)，很難得到理想的結(jié)果，導(dǎo)致該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較少，在人參研究中更是鮮有報(bào)道。

2.3　SSR分子標(biāo)記

SSR也稱作微衛(wèi)星DNA，是基因組中的1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位多次重復(fù)形成的一段DNA，基于此而開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記技術(shù)[16]。SSR標(biāo)記根據(jù)兩端相對(duì)保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)特異性引物，然后對(duì)重復(fù)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段的多態(tài)性。Hong-Il Choi等[17]應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記評(píng)估了人參品種及其相關(guān)物種間的遺傳多樣性，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增1～4條帶，表明人參具有高度重復(fù)的多倍體基因組序列。Nam-Hoon Kim等[18]使用EST-SSR開(kāi)發(fā)了19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，建立了9個(gè)韓國(guó)品種的認(rèn)證系統(tǒng)，并分析了這些品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，認(rèn)為該分子標(biāo)記將應(yīng)用于人參種子產(chǎn)業(yè)。由于SSR標(biāo)記是共顯性遺傳，具有較高的多態(tài)性，且有技術(shù)操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在人參研究中應(yīng)用較為廣泛。

2.4　ISSR分子標(biāo)記

1994年，加拿大Zietkiewicz等[19]提出了一種不需構(gòu)建繁瑣的基因文庫(kù)、隨機(jī)選取重復(fù)序列和錨定堿基，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)，即ISSR分子標(biāo)記。ISSR標(biāo)記無(wú)需知道任何靶標(biāo)序列的SSR背景信息，同時(shí)具有DNA用量少、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便且DNA多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[20]。但I(xiàn)SSR為顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型，目前在人參種質(zhì)資源研究中鮮有報(bào)道。

2.5　SRAP分子標(biāo)記

2001年，Li博士和Qu-iros博士[21]創(chuàng)立了另外一種不需預(yù)知物種基因序列，直接利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)，即SRAP分子標(biāo)記。因其具有多態(tài)性豐富、簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定、高效、高共顯性、易測(cè)序且不需預(yù)知物種基因序列信息等優(yōu)點(diǎn)，已逐步被國(guó)內(nèi)、外學(xué)者應(yīng)用于蘋(píng)果[22]、馬鈴薯[23]等果蔬的研究中。許永華[24]、宋佳等[25]對(duì)竹節(jié)參SRAP-PCR引物退火溫度和擴(kuò)增體系的dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度、DNA模板、引物等條件進(jìn)行摸索，構(gòu)建并優(yōu)化了適合竹節(jié)參DNA的SRAP-PCR擴(kuò)增體系。SRAP技術(shù)在人參中的研究鮮有報(bào)道，但許永華等基于人參SRAP反應(yīng)體系的研究成果為SRAP技術(shù)應(yīng)用于人參品種的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

2.6　SNP分子標(biāo)記

SNP是指染色體基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A，G，C，T)突變引起的多態(tài)性，變異形式多種多樣，主要有插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換等。SNP具有較高的遺傳穩(wěn)定性，是基因組中最常見(jiàn)、最簡(jiǎn)單的多態(tài)性形式，因此，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。與其它分子標(biāo)記相比，SNP分子標(biāo)記分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、易于基因分型，非常適用于種間的快速鑒定。

崔光紅等[26]利用SNP對(duì)人參、西洋參藥材進(jìn)行了鑒別，主要從特異等位基因的發(fā)現(xiàn)、PCR反應(yīng)體系、引物設(shè)計(jì)等方面全面證實(shí)了SNP在藥材鑒別中的可行性。王洪濤等[27]分別基于線粒體cox2[28]、nad7[29]以及26srDNA[30]部位的SNP位點(diǎn)鑒定了韓國(guó)品種“Chunpoong”，同時(shí)，還基于線粒體nad7部位的SNP位點(diǎn)鑒定了韓國(guó)品種“Gumpoong”和“Chungsun”。Juyeon Jung等[31]通過(guò)單核苷酸的差異，開(kāi)發(fā)了可靠、方便的葉綠體DNA標(biāo)記來(lái)鑒別韓國(guó)人參和西洋參產(chǎn)品。Xiaochen Chen等[32]基于DNA條形碼快速鑒定和分析了人參屬人參、西洋參和三七。由于其簡(jiǎn)單、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，SNP深受研究者的喜愛(ài)，現(xiàn)在在人參品種間的快速鑒定中應(yīng)用較為廣泛，尤其是在韓國(guó)，有很多學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用SNP標(biāo)記對(duì)人參進(jìn)行了深入研究。

3　問(wèn)題與展望

分子標(biāo)記輔助育種[33]是當(dāng)今作物育種的發(fā)展方向，由于人參生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且形態(tài)標(biāo)記(如根形、果色)數(shù)量有限，而分子標(biāo)記不受時(shí)間和組織器官的限制，可縮短育種周期，用于當(dāng)年選擇，因此，對(duì)人參選種育種大有裨益。將來(lái)的研究，還應(yīng)充分應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)加大對(duì)人參重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的人參抗逆性、抗病蟲(chóng)害、豐產(chǎn)、皂苷合成等特殊基因及主要功能基因的挖掘和利用，同時(shí)，與其他大田作物相結(jié)合[34]，加快在分子輔助育種上的應(yīng)用進(jìn)程。科學(xué)家們已經(jīng)取得了人參cDNA文庫(kù)[35]、葉綠體基因組[36]、EST文庫(kù)[37]等一些標(biāo)志性成果，與此同時(shí)，人參在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究將走向新的高度、開(kāi)啟新的篇章?？梢灶A(yù)見(jiàn)，在不久的將來(lái)，人參分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)也將轉(zhuǎn)向人參基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)等各種組學(xué)。相信在不久的將來(lái)隨著核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)等資源的公共化和各組學(xué)的深入研究，人參全基因組測(cè)序也必將被公布。并且，cDNA-AFLP[38，39]、cDNA-SRAP[40]和EST-SSR[41]等新型分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用必將極大推動(dòng)人參等五加科植物各方面的研究，有利于我們開(kāi)發(fā)出更為直接有效的分子標(biāo)記技術(shù)。同時(shí)，借助生物信息學(xué)等手段開(kāi)展與西洋參、竹節(jié)參、三七等近緣種核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)等資源的比對(duì)，獲取、定位大量影響重要農(nóng)藝性狀的功能基因，加快人參分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展速度，為人參優(yōu)良品種選育和種質(zhì)資源保存提供更加有力的支持。

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