過華蕾邵 暢龔儀棠陳 豪

白藜蘆醇對抗氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其機(jī)制

過華蕾1邵 暢2龔儀棠1陳 豪1

目的探討白藜蘆醇對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并隨機(jī)分為對照組、ox-LDL組、不同濃度（10μmol/ L、50μmol/L）白藜蘆醇保護(hù)組，通過檢測細(xì)胞活力、超氧化物歧化酶（SOD）水平、丙二醛（MDA）含量評價內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。RT-PCR及Western blot法檢測單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）RNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞活力、SOD水平降低[（0.33±0.01）比（0.45±0.010），（12.8±0.31）U/mL比（15.5±0.150U/mL，P＜0.05]，MDA含量增加[（2.10± 0.51）nmol/mgprot比（1.05±0.06）nmol/mgprot，P＜0.05]，MCP-1、ICAM-1 RNA表達(dá)明顯升高（1.56± 0.06比0.67±0.09，3.62±0.32比1.35±0.21，P＜0.05）；與ox-LDL組相比，白藜蘆醇（10、50μmol/L）保護(hù)組細(xì)胞活力升高（0.38±0.02、0.39±0.02比0.33±0.01，P＜0.05）、SOD水平升高[（14.4±0.61）U/mL、（14.8±0.57）U/mL比（12.8±0.31）U/mL，P＜0.05]，MDA含量減少[（1.41±0.15）nmol/mgprot、（1.37±0.05）nmol/mgprot比（2.10±0.51）nmol/mgprot，P＜0.05]，MCP-1、ICAM-1 RNA和蛋白表達(dá)明顯降低（1.03± 0.05、0.92±0.08比1.56±0.06，1.88±0.25、1.67±0.16比3.62±0.32，P＜0.05）。結(jié)論白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

動脈粥樣硬化；內(nèi)皮細(xì)胞損傷；白藜蘆醇；ox-LDL；氧化應(yīng)激

心血管疾病是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率均居首位的疾病，嚴(yán)重危害到人類健康。血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是心血管病尤其是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是公認(rèn)的動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因子，參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[1]。白藜蘆醇是一種存在于葡萄、虎杖、藜蘆等植物中的活性物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，包括抗腫瘤、延緩衰老、促腦卒中后腦功能恢復(fù)等[2-3]。對于心血管系統(tǒng)，也具有多重保護(hù)功能，如調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制血小板凝集，平衡凝血纖溶系統(tǒng)等[4]。但白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的效應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究以ox-LDL為誘導(dǎo)因子，作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激水平、單核細(xì)胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）及細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）的表達(dá)，從細(xì)胞水平探討白藜蘆醇對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有無保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 ox-LDL購自奕源生物科技有限公司、M199培養(yǎng)基、青鏈霉素、0.05%胰酶、0.25%胰酶、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS）購自美國BD公司；白藜蘆醇、噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、細(xì)胞丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。單克隆小鼠β-actin抗體、MCP-1、ICAM-1抗體購自CST公司?？故蠹翱雇玫倪B接辣根過氧化物酶的IgG（H+L）購自美國Vector公司，超敏發(fā)光液（enhanced chemiluminescence，ECL）為普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Trizol購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌條件下取新生兒臍帶（長度＞20cm），將剪成鈍端的注射針頭插入臍靜脈內(nèi)，用PBS沖洗掉管腔內(nèi)殘留的血凝塊，再用0.25%胰酶注入靜脈腔，充分消化靜脈內(nèi)皮8min后將松開止血鉗，使消化液流入預(yù)先放有1mL血清的15mL離心管中，1000r/min離心7min后可見離心管底部有白色的細(xì)胞團(tuán)塊，棄去上清后用完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，輕輕吹打混勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h換液，至細(xì)胞融合90%以上時用0.05%胰酶消化傳代，第2～5代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 取第2～5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）鋪96孔板，每組6個復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、100mg/L ox-LDL處理24h誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型組、ox-LDL加不同劑量白藜蘆醇（10、50μmol/L）處理24h的保護(hù)組。

1.4 MTT法測定細(xì)胞活力 待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理24h。每孔避光加入5g/L的MTT 20μL后置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。采用酶標(biāo)儀測定各孔OD（560nm）值。

1.5 細(xì)胞外液SOD水平、細(xì)胞中MDA含量測定待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理24h。將培養(yǎng)液移入1.5mL EP管中，3000r/min離心10min，取上清。按照SOD檢測試劑盒（WST-1法）操作說明檢測細(xì)胞外液SOD活力。將貼壁生長的HUVECs用細(xì)胞刮刮下，按照細(xì)胞丙二醛（MDA）測定試劑盒操作說明檢測細(xì)胞中MDA含量。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR 按Trizol總RNA提取試劑說明，提取內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，并測定其濃度和純度。取500ng總RNA用于cDNA合成，采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明操作。逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下：MCP-1（forward）：5’-CTGCCCTCCTGTGCCTGCTAC-3’，MCP-1（reverse）：5’-ATTCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGC-3’；ICAM-1（forward）：5’-AACTCT CCAGAACACCTCG-3’，ICAM-1（reverse）：5’-AGCA CCAGGTAGACCTTAGC-3’；β-actin（forward）：5’-AACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTT-3’，βactin（reverse）：5’-AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCT CGAAGTC-3’。合成的cDNA用于實(shí)時定量PCR反應(yīng)，采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。步驟一預(yù)變性：95℃ 30s；步驟二兩步法擴(kuò)增：95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環(huán)；步驟三溶解曲線：95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s。MCP-1和ICAM-1的表達(dá)量，通過與β-actin CT值的均數(shù)的比值來表示。

1.7 Western blotting檢測 將每組蛋白按照總量80μg計(jì)算出上樣體積，加入蛋白上樣緩沖液，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1h，然后4℃一抗搖床孵育過夜。TBST洗3次，每次10min，然后與二抗孵育1h。TBST洗3遍后顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理統(tǒng)計(jì)資料。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD-test檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞活力、SOD水平、MDA含量比較 與對照組相比，ox-LDL組HUVECs細(xì)胞活力明顯降低，SOD水平明顯下降，MDA含量明顯增多（P＜0.05）；加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護(hù)組，細(xì)胞活力明顯升高，SOD水平明顯升高，MDA含量明顯減少，與ox-LDL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力、SOD水平、MDA含量比較（±s）

表1 各組細(xì)胞活力、SOD水平、MDA含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，#P＜0.05；保護(hù)1組：ox-LDL+10μmol/L RESV；保護(hù)2組：ox-LDL+50μmol/L RESV

組別正常對照組ox-LDL組保護(hù)1組保護(hù)2組孔數(shù)6 6 6 6細(xì)胞活力0.45±0.01 0.33±0.01* 0.38±0.02#0.39±0.02#SOD（U/mL）15.5±0.15 12.8±0.31* 14.4±0.61#14.8±0.57#MDA（nmol/mgprot）1.05±0.06 2.10±0.51* 1.41±0.15#1.37±0.05#

2.2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較 與對照組相比，ox-LDL組MCP-1、ICAM-1 RNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護(hù)組，MCP-1、ICAM-1 RNA表達(dá)水平明顯降低，與ox-LDL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較（±s）

表2 各組MCP-1和ICAM-1 RNA水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，#P＜0.05；保護(hù)1組：ox-LDL+10μmol/L RESV；保護(hù)2組：ox-LDL+50μmol/L RESV

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2.3 各組MCP-1和ICAM-1蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，ox-LDL組MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá)明顯升高，而加入白藜蘆醇（10、50μmol/L）的保護(hù)組，MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，見圖1。

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及心肌梗死的發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，特別是氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是公認(rèn)的動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因子，參與動脈粥樣硬化發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[5]。血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)血管舒縮、凝血及纖溶，對抗氧自由基損傷等方面起到重要的作用。血管內(nèi)皮損傷是心血管疾病的始動環(huán)節(jié)，而血管內(nèi)皮對ox-LDL誘導(dǎo)的氧化損傷非常敏感。

圖1 各組MCP-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的比較

超氧化物歧化酶（SOD）能清除細(xì)胞中過多的氧自由基，其活力高低可間接反映細(xì)胞清除氧自由基的能力；丙二醛（MDA）是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的中間產(chǎn)物，其含量能間接證明細(xì)胞內(nèi)自由基的水平[6]。細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，而清除自由基的相關(guān)酶活性下降，是細(xì)胞損傷壞死的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ox-LDL作用可使細(xì)胞抗氧化能力降低，細(xì)胞內(nèi)自由基含量升高。白藜蘆醇可以對抗ox-LDL處理產(chǎn)生的效應(yīng)，提高細(xì)胞外SOD水平，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量。

MCP-1和ICAM-1在動脈粥樣硬化的早期病灶中已有表達(dá)，主要是促單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附、遷移。巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致MCP-1、ICAM-1表達(dá)升高[7]。ox-LDL促血小板聚集、單核細(xì)胞黏附，促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ox-LDL可以明顯降低細(xì)胞活力，使MCP-1、ICAM-1 RNA與蛋白表達(dá)顯著提高，而白藜蘆醇可以增加細(xì)胞活力，同時使MCP-1、ICAM-1 RNA與蛋白表達(dá)降低。

白藜蘆醇主要通過減少血小板聚集，促血管舒張，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)血膽固醇和甘油三酯水平來防治心血管疾病[8-9]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇的保護(hù)效應(yīng)可能是因?yàn)槠淞己玫目寡趸饔酶纳屏思?xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高細(xì)胞的抗氧化能力所致。同時它還降低內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1、ICAM-1的表達(dá)。

綜上所述，白藜蘆醇可以適度調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞趨化和黏附反應(yīng)，在早期環(huán)節(jié)改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、活力，抑制ox-LDL對內(nèi)皮的損傷，阻斷中、晚期斑塊的病理過程。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-03-14）

Protective Effect of Resveratrol on Endothelial Injury Induced by OxidizedLow Density Lipoprotein and the Involved Mechanism

GUO Hualei1,SHAO Chang2,GONG Yitang1,CHEN Hao11 Department of Pathology, Hangzhou Maternity Hospital,Hangzhou（310008）,China;2 Department of Pathology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou（310006）,China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on endothelial injury induced by oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）and its mechanism.MethodsIn vitro cultured human umbilical vein endothelial cells were randomly divided into control group,ox-LDL group,protective groups added different concentrations（10μmol/L and 50μmol/L）of resveratrol.Cell viability,superoxide dismutase（SOD）level and malondialdehyde（MDA）content were detected to evaluate the damage of endothelial cells.Expression of monocyte chemoattractant protein l（MCP-1）and intercellular adhesion molecule 1（ICAM-1）in RNA and protein level were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.ResultsCompared to control group,cell viability（0.33±0.01 vs 0.45±0.01）and SOD level（12.8±0.31U/mL vs 15.5±0.150U/mL）decreased while MDA content increased（2.10±0.51nmol/mgprot vs 1.05± 0.06nmol/mgprot）,expression of MCP-1（1.56±0.06 vs 0.67±0.09）and ICAM-1（3.62±0.32 vs 1.35±0.21）in RNA levelincreased significantly（all P＜0.05）in ox-LDL group.Compared to ox-LDL group,protective groups had increased cell viability（0.38±0.02,0.39±0.02 vs 0.33±0.01）and SOD level（14.4±0.61U/mL,14.8±0.57U/mL vs 12.8± 0.31U/mL）and decreased MDA content（1.41±0.15nmol/mgprot,1.37±0.05nmol/mgprot vs 2.10±0.51nmol/mgprot）, decreased expression of MCP-1（1.03±0.05,0.92±0.08 vs 1.56±0.06）and ICAM-1（1.88±0.25,1.67±0.16 vs 3.62± 0.32）in RNA and protein level（all P＜0.05）.ConclusionResveratrol can protect vascular endothelial cells against ox-LDL-induced injury.

resveratrol;ox-LDL;oxidative stress;atherosclerosis

1杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科（杭州 310008）；2杭州市第一人民醫(yī)院病理科（杭州 310006）

過華蕾，E-mail：jane_123@163.com