文/ 劉浩 趙廣西 楊錚

食品中12種添加劑的檢測(cè)

文/ 劉浩 趙廣西 楊錚

固相萃取－HPLC聯(lián)用法檢測(cè)12種常用食品添加劑

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)12種食品添加劑的方法，樣品前處理簡(jiǎn)單快捷、回收率高，雜質(zhì)干擾得到有效控制；色譜分離效果好；結(jié)果重現(xiàn)性好、檢出限低，可滿足各類食品中多種添加劑同時(shí)檢測(cè)的需求，能夠節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

本研究選取食品加工中最常用的防腐劑、甜味劑及人工合成色素共計(jì)12種食品添加劑（苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜、檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅）進(jìn)行研究。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道中很少有多種添加劑同時(shí)檢測(cè)的方法，而使用傳統(tǒng)方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大。因此建立一種既快捷又準(zhǔn)確，能同時(shí)測(cè)定食品中12種食品添加劑的檢測(cè)方法十分必要。本文參考相關(guān)資料，樣品前處理采用固相萃取技術(shù)富集、凈化，使用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)各類食品樣品中的12種添加劑，并對(duì)各試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，本法簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高, 適用于各類食品樣品中添加劑的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)條件

主要材料與試劑

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液、莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液、靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甲醇（迪馬公司）；乙酸銨（天津市化學(xué)試劑三廠）。

主要儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫）；臺(tái)式高速離心機(jī)；超聲波清洗儀；旋渦混合器（國(guó)力天科技有限公司）；固相萃取小柱（Waters Oasis WAX，預(yù)先經(jīng)5 ml甲醇、5 ml水、2%的甲酸水溶液5 ml活化)；樣品：超市和市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

色譜條件

色 譜 柱：CNW Athena C18-WP (4.6×250 mm,5 μm)；柱溫：20.0℃；流動(dòng)相：A：甲醇，B：乙酸銨溶液（0.02 mol/ L+5%甲醇），梯度洗脫見(jiàn)表1；流速1 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、日落黃483 nm、胭脂紅509 nm、亮藍(lán)630 nm、靛藍(lán)608 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅和赤蘚紅波長(zhǎng)530 nm、山梨酸和苯甲酸 230 nm、糖精鈉和安賽蜜214 nm。

液體樣品處理

稱取液體樣品10 ml于100 ml離心管中,加入0.2 ml甲酸，渦旋混勻1 min后，超聲提取10 min，離心，經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾，取5 ml上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 ml的2%甲酸淋洗，5 ml的5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 ml進(jìn)樣。

固體樣品處理

稱取固體樣品2 g于100 ml離心管中,加入25 ml乙醇：氨水：水(9：0.5：0.5)混合溶劑勻漿，渦旋1 min后超聲提取30 min、離心、殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并提取液旋蒸定容10 ml，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取5 ml上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 ml的2%甲酸淋洗，5 ml的5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 ml進(jìn)樣。

表1.流動(dòng)相梯度洗脫程序

實(shí)驗(yàn)與分析

前處理的選擇

食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，而且同時(shí)檢測(cè)12種添加劑并保證結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高，這對(duì)前處理提出了很高的要求。幾種添加劑均可溶于水因此文獻(xiàn)往往采用直接濾膜過(guò)濾后檢測(cè)，但對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，極易造成系統(tǒng)的污染。選擇合適的前處理方法，可以去除雜質(zhì)，降低基線雜質(zhì)噪音。文獻(xiàn)中前處理的步驟往往繁瑣耗時(shí)、回收率偏低，本文從添加劑自身化合物性質(zhì)出發(fā)，結(jié)合文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了樣品前處理方法。

沉淀劑

部分固體樣品中含有蛋白質(zhì)，如果蛋白沉淀劑選擇不當(dāng)，將對(duì)后期實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀去除蛋白，但這一過(guò)程中部分防腐劑、色素也被沉淀吸附，會(huì)降低回收率。作者采用氨水：乙醇：水溶液進(jìn)行提取。糖精鈉、苯甲酸和山梨酸在堿性條件下以鹽的形式存在，可以溶于強(qiáng)極性的溶劑。安賽蜜易電離，合成色素是水溶性化合物，易溶于水及極性溶液；濃度90%以上的乙醇又可以使蛋白質(zhì)脫水，促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝聚，同時(shí)乙醇可起到破壞沉淀膠體減少干擾的作用。本文通過(guò)對(duì)不同比例的氨水乙醇水溶液進(jìn)行比較，最終確定實(shí)驗(yàn)比例。

固相萃取柱

提取液可同時(shí)將糖和某些脂溶性成分提取出，影響基線穩(wěn)定性并形成雜質(zhì)干擾，所以選取固相萃取小柱進(jìn)行凈化。根據(jù)文獻(xiàn)試驗(yàn)考察了不同分離模式的固相萃取柱，包括：反相C18-HLB固相萃取柱)和弱陰離子交換WAX柱固相萃取柱、強(qiáng)陰離子交換MAX固相萃取柱。HLB柱以親水一親脂共聚物吸附劑為固定相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HLB柱對(duì)安賽蜜、糖精鈉和胭脂紅、赤蘚紅回收率較低，尤其赤蘚紅僅在20%左右。所以試驗(yàn)又對(duì)其他小柱進(jìn)行了考察，強(qiáng)陰離子交換MAX無(wú)法保留糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸，實(shí)驗(yàn)中，糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸回收率僅為35%，原因可能是當(dāng)pH為8～9時(shí)，這四種物質(zhì)的分子狀態(tài)不穩(wěn)定，無(wú)法保留在MAX柱上。

Oasis WAX屬于混合型弱陰離子交換反相吸附柱，可以有效地去除雜質(zhì)干擾，提高回收率。幾種甜味劑和防腐劑同時(shí)帶有有機(jī)官能團(tuán)和可離子化官能團(tuán)在中性和偏酸性條件下，電離效果降低，主要以中性分子的形式存在，利用反相柱的吸附作用形成保留。而赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)，也存在一定保留，其他合成色素為苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)含有磺酸基，屬?gòu)?qiáng)陰離子化合物，利用弱陰離子交換作用形成保留效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤蘚紅回收率偏低，可能是赤蘚紅的苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)，相對(duì)其他苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)的著色劑，保留較弱；其次甲醇及甲酸可對(duì)赤蘚紅部分洗脫，與小柱結(jié)合較弱的赤蘚紅也被部分洗脫；另外混合纖維素膜對(duì)赤蘚紅有較強(qiáng)吸附，常用的聚醚砜和尼龍濾膜對(duì)部分色素也有很強(qiáng)的吸附作用，最后采取0.45 μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾。

圖1. 12種添加劑標(biāo)準(zhǔn)分離譜圖。

流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)選取純水和甲醇、乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨體系分別進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)純水和甲醇流動(dòng)相無(wú)法使安賽蜜、苯甲酸和山梨酸有效分離?？赡苁且?yàn)橹行詶l件下，部分甜味劑和防腐劑以陰離子的形式存在，與色譜柱的固定相之間的作用較弱，分離效果差；在弱酸性流動(dòng)相中可使苯甲酸和山梨酸主要以中性分子形式存在，與固定相之間的相互作用顯著增強(qiáng)，分離效果得到明顯改善。試驗(yàn)表明，合成色素的分離效果受pH值影響較小。

乙腈-乙酸銨體系無(wú)法使部分合成色素（如胭脂紅、日落黃）有效分離，而甲醇-乙酸銨各添加劑得到有效分離、峰形最佳。進(jìn)一步選用0.01 mol/ L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在0.02 mol/L時(shí)各種添加劑的峰形和分離效果達(dá)到最佳；當(dāng)濃度再增大時(shí)，峰形和分離效果無(wú)明顯增強(qiáng)。這主要是因?yàn)槿跛嵝缘闹幸宜徜@緩沖鹽溶液含有羧酸基團(tuán)可對(duì)甜味劑和防腐劑有更強(qiáng)的洗脫能力，因此最終選用0.02 mol/L甲醇-乙酸銨流動(dòng)相體系。

檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、誘惑紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)8種合成色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有苯磺酸基，有較強(qiáng)的紫外吸收特性。同時(shí)各種色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中所含的發(fā)色團(tuán)及助色團(tuán)不同而呈現(xiàn)不同的顏色，在可見(jiàn)光區(qū)也有各自的較強(qiáng)的吸收。標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用紫外光譜儀進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在210 nm附近處有較大吸收峰，但由于樣品中很多干擾物在此波長(zhǎng)下都有吸收，因此優(yōu)先選擇可見(jiàn)波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最后確定為：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、日落黃483 nm、胭脂紅509 nm、亮藍(lán)630 nm、靛藍(lán)608 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅和赤蘚紅波長(zhǎng)530 nm。GB/T 5009.35-2003第一法選擇254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，其他色素可以很容易的檢出，只有亮藍(lán)靈敏度很低，選擇可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)后，亮藍(lán)和赤蘚紅的靈敏度明顯提高并且干擾物影響小。

作者對(duì)甜味劑和防腐劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)分別為：安賽蜜226 nm、糖精鈉202 nm、苯甲酸224 nm、山梨酸253 nm。由于流動(dòng)相在低于200 nm下有吸收，會(huì)造成噪音過(guò)高，250 nm處苯甲酸、糖精鈉靈敏度太低不能滿足檢測(cè)需要，為此選230 nm為苯甲酸、山梨酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。安賽蜜、糖精鈉的最大吸收波長(zhǎng)分別在226 nm及202 nm處，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)作者選取靈敏度相近的214 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

干擾試驗(yàn)

在實(shí)際樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn), 某些食品基質(zhì)中可以對(duì)安賽蜜與糖精鈉的測(cè)定造成干擾。如酒類產(chǎn)品中的糠醇等存在與糖精鈉接近的化學(xué)結(jié)構(gòu),保留時(shí)間與吸收光譜均類似，易造成假陽(yáng)性判定。建議進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)或輔助進(jìn)行光譜掃描或串聯(lián)熒光檢測(cè)器，進(jìn)行驗(yàn)證。

標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將12種標(biāo)準(zhǔn)品用水配制成濃度分別為：0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.06 mg/ ml、0.08 mg/ml、0.10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表2。

表2. 回歸分析結(jié)果和檢出限

表3. 不同食品的測(cè)定結(jié)果回收率

結(jié)果與分析

回收率的分析

取5 種不同類型食品，分別用本方法制成樣品溶液，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使標(biāo)品濃度分別為0.02 mg/ ml、0.04 mg/ml、0.06 mg/ml、0.80 mg/ ml、0.10 mg/ml，按上文樣品前處理方法進(jìn)行處理后檢測(cè)，回收率見(jiàn)表3，可以滿足檢測(cè)要求。

實(shí)際樣品分析

本文研究針對(duì)市場(chǎng)上的20種食品樣品進(jìn)行了抽檢。經(jīng)過(guò)分析可得出結(jié)論，添加防腐劑、甜味劑、色素較為常見(jiàn)，部分散裝食品中檢出合成色素和甜味劑，并部分超標(biāo)。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于防腐劑、甜味劑、合成色素三類食品添加劑的檢測(cè)方法多為單獨(dú)檢測(cè)，即使查一些文獻(xiàn)資料，也多是關(guān)于同一類多種添加劑、防腐劑或甜味劑的同時(shí)檢測(cè)方法。而關(guān)于三類食品添加劑同時(shí)檢測(cè)的研究報(bào)道比較少。這主要是因?yàn)椋愂称诽砑觿┑臉悠非疤幚矸绞缴杂胁煌?，其中，防腐劑和甜味劑的前處理多為溶解稀釋過(guò)程，而合成色素還需要凈化和富集。同時(shí)由于食品基質(zhì)復(fù)雜、雜質(zhì)干擾大，回收率難以滿足要求，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以令人滿意。

小結(jié)

本研究從目標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)出發(fā)，充分考慮樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，優(yōu)化選擇了合適的蛋白沉淀劑和固相萃取柱，建立了適合的前處理方法，并通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立了一種多類型食品添加劑同時(shí)檢測(cè)的方法，可同時(shí)檢測(cè)各類食品中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉、檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅12種添加劑的含量。本方法樣品前處理簡(jiǎn)單快捷，回收率高；雜質(zhì)干擾得到有效控制，色譜分離效果好；檢測(cè)選擇性強(qiáng)，重現(xiàn)性好,檢出限低，可以滿足各種類食品中添加劑檢測(cè)要求，能夠節(jié)約大量的實(shí)驗(yàn)成本。

本文作者來(lái)自國(guó)家葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心。