張朝暉，張宗申，陳 陽，李 毅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院/遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室，遼寧 大連 116034)

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雜交構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)研究

張朝暉，張宗申*，陳 陽，李 毅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院/遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室，遼寧 大連 116034)

以雜交構(gòu)樹葉片為材料，建立通過愈傷組織制備體細胞胚的技術(shù)途徑。結(jié)果表明，光照強度750 lx、構(gòu)樹幼葉面積4～5 cm2有利于誘導(dǎo)愈傷組織。最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，pH值6.0，其愈傷組織誘導(dǎo)率達94.6%。構(gòu)樹愈傷組織最佳繼代培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT，pH值6.2，愈傷組織增殖速度快。選擇表面顆粒多、質(zhì)地松軟、淺黃色或白色的愈傷組織進行體細胞胚誘導(dǎo)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH值6.4，體細胞胚的發(fā)生頻率達到96.0%。

雜交構(gòu)樹； 愈傷組織； 體細胞胚

構(gòu)樹[Broussonetiapapyrifera(L.)L’ Herit]屬?？?Moraceae)植物，是園林綠化的優(yōu)良樹種[1]，同時可作為造紙、加工青儲飼料和提取降糖藥物等原材料[2-4]。構(gòu)樹種苗的市場需求量很大，但目前構(gòu)樹種苗繁育的主要方式依舊是傳統(tǒng)扦插方式，不但耗時費力、繁育周期長、占用土地面積廣，而且存在季節(jié)性限制問題。因此僅僅依靠扦插等傳統(tǒng)育苗方式很難滿足市場對構(gòu)樹種苗的需求[5]。同時近幾年人們嘗試采用組培技術(shù)進行構(gòu)樹種苗的快繁育種，雖然提高了種苗的繁殖效率，但仍然存在著人工成本過高等問題。

以體細胞胚為材料制備人工種子的細胞工程技術(shù)成為解決構(gòu)樹種苗繁育問題的有力工具之一。體細胞胚是由孢子體或配子體的細胞通過無性繁殖產(chǎn)生的一種類似于合子胚的結(jié)構(gòu)，與合子胚一樣具有原胚、心形胚、魚雷胚及具子葉的成熟胚的發(fā)育程序[6]。植物組織、單細胞、原生質(zhì)體和花粉等培養(yǎng)過程中都有體細胞胚發(fā)生[7-10]，發(fā)生途徑包括從組織或細胞直接發(fā)生和經(jīng)過愈傷組織階段再分化為體細胞胚2種途徑[11]。體細胞胚可以在生物反應(yīng)器中通過懸浮方式進行培養(yǎng)，培養(yǎng)密度可以達到11 000個/L甚至更高，而且整個培養(yǎng)過程可以實現(xiàn)自動化控制，既提高了效率又降低了培養(yǎng)的人工成本[12]。通過體細胞胚誘導(dǎo)方式進行育種的可行性，已經(jīng)在東北矮紫衫的育種過程中得到充分證明[13-14]。因此，將該技術(shù)體系應(yīng)用于構(gòu)樹種苗生產(chǎn)，可以解決傳統(tǒng)繁育中存在的系列問題。本研究以雜交構(gòu)樹為試驗材料，通過愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和體細胞胚分化培養(yǎng)，建立可行、易操作、高效率的構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)技術(shù)體系，為獲得大量植株再生苗或制備人工種子提供技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為雜交構(gòu)樹組培苗，由大連工業(yè)大學(xué)藥用植物細胞工程實驗室提供；6-BA、2,4-D、NAA和KT等植物生長調(diào)節(jié)劑購自江蘇省激素研究所股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 選擇MS作為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的6-BA、2,4-D(表1)，添加蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，每種組合10瓶，每瓶接種5枚構(gòu)樹葉片。培養(yǎng)條件：溫度(24±1) ℃，光照強度1 500 lx，光照周期12 h/d。培養(yǎng)20 d，觀察記錄愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計出現(xiàn)愈傷組織的數(shù)量，并計算誘導(dǎo)率。

表1 構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗因素和水平

1.2.2 外植體大小及光照條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將外植體葉片大小設(shè)定為1 cm2、2～3 cm2、4～5 cm23個水平，光照條件設(shè)為強光培養(yǎng)(A組，白熾燈直射光照強度2 500 lx)、弱光培養(yǎng)(B組，白熾燈非直射光照強度750 lx)和黑暗培養(yǎng)(C組)3個水平，光照周期設(shè)定為12 h/d，共進行9組試驗，每組重復(fù)10瓶，培養(yǎng)溫度(24±1)℃。培養(yǎng)20 d，觀察記錄愈傷組織誘導(dǎo)情況并計算誘導(dǎo)率。

1.2.3 構(gòu)樹愈傷組織繼代培養(yǎng)基的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的6-BA和KT(表2)，其中添加蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH值調(diào)至6.2；溫度(24±1)℃；黑暗培養(yǎng)；繼代周期為20 d。每組試驗配制20瓶培養(yǎng)基，每瓶接種5～8塊愈傷組織，單塊愈傷組織體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。經(jīng)過1個繼代周期培養(yǎng)后，觀察并統(tǒng)計愈傷組織生長狀態(tài)。

表2 構(gòu)樹愈傷組織繼代培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑處理

1.2.4 構(gòu)樹體細胞胚的誘導(dǎo) 選取經(jīng)過繼代培養(yǎng)2～3次、質(zhì)地疏松易碎、生長狀態(tài)良好的塊狀構(gòu)樹愈傷組織，培養(yǎng)條件：以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度NAA、6-BA(表3)，其中添加蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH值調(diào)至6.2；溫度(24±1)℃。每種組合10瓶，每瓶接種5塊愈傷組織。

表3 構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)正交試驗因素和水平

1.2.5 構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)效果的評定指標(biāo) 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)35 d后，選取3個指標(biāo)用于評估體細胞胚的誘導(dǎo)效果：體細胞胚發(fā)生頻率、體細胞胚平均數(shù)量、體細胞胚發(fā)生效率。體細胞胚發(fā)生頻率=有體細胞胚發(fā)生的外植體樣本數(shù)/接種外植體樣本數(shù)×100%，體細胞胚平均數(shù)量=發(fā)生體細胞胚的總數(shù)/有體細胞胚發(fā)生的外植體樣本數(shù)，體細胞胚發(fā)生效率=體細胞胚發(fā)生頻率×體細胞胚平均數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

構(gòu)樹葉片在16種不同組合的培養(yǎng)基中均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織。在誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)5 d后即可觀察到外植體與培養(yǎng)基接觸部位開始膨脹，出現(xiàn)淡黃色顆粒；培養(yǎng)10 d后，外植體表面聚集大量淡黃色或白色顆粒，即為胚性愈傷組織；培養(yǎng)17 d后，愈傷組織開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，表明開始進入生長末期。從表4可以看出，各因素對構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)率的影響大小為：6-BA>pH值>2,4-D。從誘導(dǎo)率的極差分析結(jié)果可知，構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)的最佳精品培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，pH值6.0。通過驗證試驗，最佳培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率可達94.6%，而16組處理的平均愈傷組織誘導(dǎo)率僅為65.5%。

表4 愈傷組織誘導(dǎo)的正交優(yōu)化結(jié)果

2.2 外植體大小與光照對構(gòu)樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在上述優(yōu)化植物生長調(diào)節(jié)劑組合與pH值的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進一步研究外植體大小與光照條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，誘導(dǎo)結(jié)果如圖1所示。黑暗條件下愈傷組織誘導(dǎo)率明顯偏低，強光和弱光下的誘導(dǎo)率相差不大，其中B組750 lx光照條件下誘導(dǎo)率更高。外植體大小對誘導(dǎo)愈傷組織影響很大，1 cm2大小的葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率較低；2～3 cm2的葉片可成功誘導(dǎo)愈傷組織，但所得愈傷組織量較少且易碎不成形，易死亡；4～5 cm2的外植體葉片誘導(dǎo)率最高，并且誘導(dǎo)所得愈傷組織顆粒飽滿，生長狀態(tài)極佳。因此，選擇4～5 cm2的外植體葉片在750 lx光照條件下進行愈傷組織的誘導(dǎo)。

圖1 外植體大小與光照條件對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.3 構(gòu)樹愈傷組織繼代培養(yǎng)的優(yōu)化結(jié)果

從表5可以看出，6-BA在愈傷組織繼代的過程中起著主導(dǎo)作用，質(zhì)量濃度過高會延緩愈傷組織的生長；缺乏6-BA的處理，愈傷組織則表現(xiàn)為生長緩慢、質(zhì)地密實且色澤深褐。Y2處理中愈傷組織生長狀態(tài)最佳，適量的6-BA在少量KT的輔助作用下，能達到良好的繼代培養(yǎng)效果。因此選擇MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT作為愈傷組織繼代培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表5 愈傷組織繼代培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑優(yōu)化結(jié)果

注：+表示生長狀態(tài)一般，++表示生長狀態(tài)良好，+++表示生長狀態(tài)最佳，—表示生長狀態(tài)不佳。

2.4 構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)的優(yōu)化結(jié)果

表6顯示，R6-BA>RNAA>RpH，說明這3個因素對于體細胞胚誘導(dǎo)影響的大小順序為：6-BA>NAA>pH。比較各因素的均值K，最大的值分別是：因素6-BA的K4，因素NAA的K2，因素pH的K3，通過極差分析可知理論最優(yōu)組合為處理14，即2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH值6.4，其誘導(dǎo)效果在胚胎發(fā)生頻率、胚平均數(shù)以及胚胎發(fā)生效率3項評定指標(biāo)方面均處于最高水平，體細胞胚發(fā)生頻率達到96.0%，而16個處理組的平均胚胎發(fā)生頻率僅為39.9%。因此構(gòu)樹體細胞胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH值6.4。

如圖2所示，先將截取的構(gòu)樹葉片做傷口切割處理，經(jīng)過17 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成顆粒狀愈傷組織，并繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d。經(jīng)過2～3個周期繼代培養(yǎng)，待其生長狀態(tài)穩(wěn)定后將愈傷組織置于誘導(dǎo)體細胞胚的培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH值6.4，蔗糖30 g/L，瓊脂5 g/L)中，經(jīng)過35 d，出現(xiàn)綠色球狀胚。進一步進行光照培養(yǎng)，于13 d開始出現(xiàn)嫩芽，后續(xù)培養(yǎng)表明可長成個體植株，驗證了利用該技術(shù)途徑進行構(gòu)樹種苗培育的可行性。

表6 體細胞胚誘導(dǎo)的正交優(yōu)化結(jié)果

A.外植體葉片； B.培養(yǎng)17 d，箭頭示顆粒狀愈傷組織；C.培養(yǎng)25 d，箭頭示顆粒狀體細胞胚； D—E.培養(yǎng)35 d，箭頭示體細胞胚逐漸發(fā)育成芽

3 結(jié)論與討論

在植物細胞組織培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑對細胞生長分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，特別是生長素和細胞分裂素之間的配比更是直接影響植物細胞分化的方向[15]。在構(gòu)樹愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)了與前人[16]一致或相似的結(jié)果，即6-BA和2,4-D協(xié)同作用更有利于構(gòu)樹愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，6-BA對于體細胞胚的誘導(dǎo)影響最大，NAA及pH值次之，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度一定時，體細胞胚的誘導(dǎo)率隨著NAA質(zhì)量濃度變化呈現(xiàn)拋物線變化趨勢，這與戴力等[17]在美國SL-9甘薯莖尖脫毒組織培養(yǎng)中對最適植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比的研究結(jié)果極為相似。植物生長調(diào)節(jié)劑之間的組合對體細胞胚的誘導(dǎo)率有著直接影響。通常植物愈傷組織在誘導(dǎo)過程中的光照條件均為暗誘導(dǎo)[18]，然而本試驗中，雜交構(gòu)樹外植體于遮光條件下的誘導(dǎo)效果并沒有光照條件下的誘導(dǎo)效果好，暗條件下誘導(dǎo)率最低，獲得的愈傷組織質(zhì)地較硬，顆粒少且不豐滿，若繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織則會發(fā)生褐化、干枯甚至死亡，很少有體細胞胚的發(fā)生。由此推斷，雜交構(gòu)樹于光照條件下的誘導(dǎo)效果更佳，可能是由于雜交構(gòu)樹系強陽性樹種[19-20]，在誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織的過程中，配合雜交構(gòu)樹的植物特性，使得外植體攝取適當(dāng)?shù)墓庹眨軌蛟鰪娡庵搀w中植物細胞的活性，從而得以提高愈傷組織誘導(dǎo)的成功率。然而，通過光照誘導(dǎo)得到的愈傷組織的繼代培養(yǎng)方式以弱光條件下培養(yǎng)為宜。于光照條件下進行繼代培養(yǎng)的愈傷組織會出現(xiàn)纖維化、衰老、死亡的情況，這與其強陽性樹種的特性完全相悖。由此可以推斷，通過誘導(dǎo)得到的愈傷組織細胞，已經(jīng)不具有雜交構(gòu)樹的強陽性特性，其對于光信號的調(diào)控機制已經(jīng)發(fā)生了改變，更傾向于弱光條件的培養(yǎng)環(huán)境。

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Induction ofBroussonetiapapyriferaSomatic Embryo

ZHANG Chaohui,ZHANG Zongshen*,CHEN Yang,LI Yi

(Key Laboratory of Fermentation Engineering of Liaoning Province/School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

This study is mainly to establish an efficient protocol for obtaining somatic embryo ofBroussonetiapapyriferafrom leaves-derived callus.The results showed that young leaves of 4—5 cm2and 750 lx were suitable for callus induction,and the formula of MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D,pH 6.0 was demonstrated to be the best for callus induction with the induction rate of 94.6%.The preferred subculture media forB.papyriferacallus multiplication was MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT,pH 6.2,on which the callus grew fast.The light yellow or white callus with granules and fragile texture was chosen for induction of somatic embryo,and the formula of MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH 6.4 was proven to be the best with the somatic embryogenesis rate of 96.0%.

Broussonetiapapyrifera; callus; somatic embryo

2016-07-19

河南省科技創(chuàng)新杰出人才項目(134200510002)

張朝暉(1991-)，男，遼寧鞍山人，在讀碩士研究生，研究方向：藥用植物細胞工程。E-mail：474757591@qq.com

*通訊作者：張宗申(1968-)，男，河南周口人，教授，博士，主要從事藥用植物細胞工程研究。E-mail：zhangzs@dlpu.edu.cn

時間：2016-11-25 14:24:33

S792.99

A

1004-3268(2016)12-0127-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.014.html