魏小春，李 艷，姚秋菊，原玉香，趙艷艷，王志勇，姜 俊，段俊枝，蔣武生，張曉偉*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002； 2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院，河南 駐馬店 463000；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

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辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物脅迫下表達分析

魏小春1，李 艷2，姚秋菊1，原玉香1，趙艷艷1，王志勇1，姜 俊2，段俊枝3，蔣武生1，張曉偉1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002； 2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院，河南 駐馬店 463000；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

為揭示CaCBF1A基因在辣椒抗逆機制中發(fā)揮的功能，對辣椒CaCBF1A基因進行克隆與分析。以豫椒101為材料，根據(jù)參考基因組序列設計引物，通過PCR技術(shù)從辣椒基因組cDNA中獲得CBF基因CaCBF1A。經(jīng)生物信息學分析，該基因具有一個完整的ORF(471 bp)，編碼156個氨基酸。CaCBF1A編碼的蛋白質(zhì)包含保守的AP2 DNA結(jié)合域。對其亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)進行分析，預測其定位在葉綠體中，存在跨膜結(jié)構(gòu)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，低溫、高溫和鹽脅迫均可誘導CaCBF1A基因的表達，其表達量在迅速達到峰值后又降低，說明CaCBF1A是一個逆境脅迫快速響應基因，推測其在辣椒抗逆機制中起著重要的作用。

辣椒； CBF基因； 基因克隆； 非生物脅迫； 表達分析

辣椒(CapsicumannuumL.)原產(chǎn)于中南美洲熱帶雨林地區(qū)的墨西哥、秘魯?shù)鹊兀瑢偾芽评苯穼僦参?，果實?nèi)含有豐富的維生素C、糖類和辣椒素等營養(yǎng)物質(zhì)。辣椒在我國各地普遍栽培，但在整個生育過程中，從播種到果實收獲，其會時時刻刻受到干旱、低溫、高溫等非生物脅迫，輕者使植物生長發(fā)育受阻，重者導致植株死亡。

植物在應對非生物脅迫的過程中通常會發(fā)生一系列的生理生化反應，并且形成了一定的脅迫防御機制[1]，脅迫防御機制主要是通過防御反應基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制發(fā)生作用的[2]。在防御反應基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能區(qū)域與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件結(jié)合，從而來調(diào)控基因的表達。當然，一些轉(zhuǎn)錄因子其自身也受誘導調(diào)控，改變特定轉(zhuǎn)錄因子的表達條件會使植物的脅迫抗性發(fā)生很大變化[3]。CBF基因?qū)儆贏P2/EREBP基因家族，是一種受逆境特異誘導表達的轉(zhuǎn)錄因子，可激活下游多個效應基因的表達，從而提高植物對低溫、干旱等多種逆境脅迫的抗性[4-5]。

1 材料和方法

1.1 材料

辣椒材料豫椒101，由河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所蔬菜育種課題組繁育。完全營養(yǎng)液為霍格蘭-阿農(nóng)配方。基質(zhì)有機質(zhì)、速效氮、速效鉀、速效磷的含量分別為219 g/kg、1.765 9 g/kg、1.730 g/kg、0.093 6 g/kg，pH值為5.46。

1.2 方法

1.2.1 辣椒苗的準備 供試辣椒種子用紗布包好，先在55 ℃的熱水中溫湯浸種20 min，然后室溫條件下充分吸水6～8 h，播于營養(yǎng)缽(6 cm×8 cm)中，每穴1～2粒種子。待子葉出土后放于光照強度為300～600 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，生長溫度控制在25 ℃/18 ℃(晝/夜)，出苗后澆1/2營養(yǎng)液，每缽留壯苗1株，長至四葉一心時轉(zhuǎn)苗至大營養(yǎng)缽(10 cm×10 cm)中。當幼苗第5片真葉展開時移入人工氣候箱進行處理。

1.2.2 材料處理 低溫處理：當植株6～8片真葉展平時，將穴盤放入預先降溫到4 ℃(晝)/0 ℃(夜)的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行低溫處理，光照強度為160 μmol/(m2·s)、光周期為12 h光/12 h暗。高溫處理：當植株6～8片真葉展平時進行高溫處理，控制晝/夜溫度為(45±2)℃/(35±2)℃。鹽處理：設置CK (不加NaCl)和加NaCl 200 mmol/L 2個處理。每個處理重復3次，每個重復10株。每處理的材料數(shù)30株，未處理材料為對照。處理時間為0、6、12、24、48、96 h。取樣后立即浸入液氮中，并放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 辣椒總RNA提取和cDNA第一鏈合成 總RNA的提取采用TRIZOL法(USA)。cDNA第一鏈合成采用Thermo Scientific公司cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

上面一聽就樂了，非常滿意，認為它比批斗更能觸及靈魂。農(nóng)民詩人李錦文聽說嗎？發(fā)表過很多打油詩，當年在省里影響蠻大，自嘲“李打油”，他得知此事蠻惱火，仗著認識幾個上面的人，就要為我父親去伸張正義。何止斯文掃地呀，斯文竟然去豬圈爬騷打花啦！我父親在村口堵住他說：我李家自古崇文重教，把六十歲以上老者叫作老成，高中以上學歷叫斯文，在祠堂里敬祖、喝酒，老成、斯文站前排、坐上席，這是秩序，也是風尚。叫我牽豬牯當花博士，好啊，你二伯妙招呀，你想想受辱的到底是哪個。

1.2.4 基因引物設計與合成 根據(jù)辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppergenome.snu.ac.kr/)中CBF基因(CA03g15650)的序列，在5′UTR及3′UTR設計引物(表1)，委托Invitrogen生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1 辣椒CaCBF1A基因克隆及其表達檢測所用引物

1.2.5CaCBF1A基因cDNA全長克隆 以第一鏈cDNA為模板，用CBF基因引物進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，反應35個循環(huán)。

PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，回收片段與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接，熱擊法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆送公司測序，得到目的片段序列。PCR酶試劑(SeqAmpTMDNA Polymerase)購自Clontech公司，Marker DL2000購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.2.6 序列分析 利用ClustalX 2軟件對克隆的CaCBF1A基因的核苷酸及其編碼氨基酸序列與其他物種的對應序列進行比對分析；根據(jù)所得的cDNA序列，利用NCBI的Blastp分析工具對基因所編碼的氨基酸進行同源序列比對，并結(jié)合MEGA 4.0構(gòu)建進化樹；利用軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對CaCBF1A基因編碼的氨基酸組分、分子量和等電點進行分析；利用軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的親/疏水性；利用軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預測；利用軟件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)進行亞細胞定位的預測。

1.2.7 實時熒光定量分析 對上述高溫、低溫及鹽脅迫處理后的辣椒葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR反應體系為20.0 μL，含有10.0 μL 2×SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)，2.0 μL cDNA，上、下游引物(qCBFF135及qCBFR339)各1 μL(引物濃度10 μmol/L)，6 μL ddH2O。運行程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40次循環(huán)。每個樣品重復3次。

以Actin基因為內(nèi)參，擴增引物為cACTINF228和cACTINR384。實時熒光定量PCR儀為羅氏公司LightCycler?96。采用2-△△CT法計算基因相對表達量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaCBF1A基因的克隆

以辣椒cDNA第1條鏈為模板，用引物CBFF/CBFR擴增出600 bp左右的目的片段(圖1)，將目的片段回收后連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆用引物檢測后測序。測序結(jié)果顯示，該片段與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中目的片段完全一致，大小為596 bp，該基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG具有一個完整的ORF(471 bp)，編碼156個氨基酸。

M.DL2000

2.2 辣椒CaCBF1A基因編碼氨基酸序列的同源性分析

對辣椒CaCBF1A基因編碼的氨基酸序列在NCBI中進行Blastp比對分析，結(jié)果顯示其蛋白質(zhì)含有AP2/EREBP基因家族保守的AP2 DNA結(jié)合域(圖2)。將辣椒CaCBF1A基因編碼的氨基酸序列與其他物種的CBF基因編碼的氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明，辣椒CBF1A氨基酸與其他作物CBF氨基酸有高度的相似性，屬于CBF家族(圖3)。

圖2 CaCBF1A基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

圖3 辣椒CaCBF1A編碼氨基酸序列與其他作物CBF編碼氨基酸序列比對

2.3 辣椒CaCBF1A蛋白理化性質(zhì)的預測

利用ProtParam軟件預測辣椒CaCBF1A蛋白分子質(zhì)量為17.058 ku，理論等電點為4.29，分子式為C765H1153N191O236S8。該蛋白質(zhì)中含量最高的氨基酸為Ser，相對含量達到了12.2%，含量較低的氨基酸有Cys、His和Trp，共計為1.2%，不含有Pyl和Sec。其脂肪系數(shù)為77.63，疏水性平均值為0.043。說明該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。

2.4 辣椒CaCBF1A蛋白亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)及疏水性分析

利用BaCelLo軟件對辣椒CaCBF1A進行亞細胞定位的預測，結(jié)果表明其定位在葉綠體中(圖4)。

蛋白質(zhì)的多肽鏈通過折疊、螺旋和卷曲等二級結(jié)構(gòu)形成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，利用軟件分析CaCBF1A的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)多個氨基酸參與α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等二級結(jié)構(gòu)的形成，其中α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲分別占42.95%、12.18%、7.05%和37.82%(圖5)。這4個結(jié)構(gòu)是構(gòu)成CaCBF1A蛋白的基本結(jié)構(gòu)。

圖4 辣椒CaCBF1A蛋白亞細胞定位預測

h、e、t和c分別代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲

采用ProtScale對CaCBF1A蛋白的疏水性進行分析(圖6)，整體來看，親水性氨基酸和疏水性氨基酸在整個蛋白質(zhì)中分布不均勻，有明顯的疏水區(qū)。

2.5 辣椒CaCBF1A蛋白進化樹分析

使用NCBI中Blastp工具對辣椒CaCBF1A氨基酸序列進行同源性檢索，對檢索到的數(shù)據(jù)再利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，辣椒CaCBF1A與茄屬(Solanum)植物CBF1親緣關(guān)系最近，而與楊屬(Populus)、葡萄屬(Vitis)植物等親緣關(guān)系較遠(圖7)。

圖6 辣椒CaCBF1A蛋白親疏水性預測

圖7 辣椒及其他物種CBF蛋白進化樹分析

2.6 辣椒CaCBF1A基因在不同逆境脅迫下的表達分析

利用熒光定量PCR儀分別檢測辣椒CaCBF1A在低溫脅迫、高溫脅迫和鹽脅迫下的相對表達量。結(jié)果表明，CaCBF1A基因在低溫脅迫后表達量迅速升高后又下降，在12 h時表達量迅速達到峰值，約為對照的135倍，24 h后僅為對照的28倍(圖8a)；CaCBF1A基因在高溫脅迫12 h后表達量迅速升為對照的172倍，在24 h時迅速恢復正常，總體上表達量先逐漸升高達到峰值后下降，隨著處理時間的延長又呈逐漸上升的趨勢(圖8b)；CaCBF1A基因在鹽脅迫后表達量逐漸升高后又逐漸下降，在鹽脅迫12 h時表達量達到峰值，約為對照的20倍(圖8c)。

圖8 逆境脅迫下CaCBF1A基因在葉片中的表達情況

3 結(jié)論與討論

AP2/EREBP是一種受逆境特異誘導的轉(zhuǎn)錄因子，可激活下游多個效應基因的表達[4]。CBF基因?qū)儆贏P2/EREBP基因家族，具有AP2 DNA結(jié)合域，該結(jié)合域是植物基因特有的結(jié)合域[7]。CRT/DRE是高等植物抗逆相關(guān)基因中的一種順式作用因子，CBF基因中的AP2 DNA結(jié)合域能夠識別CRT/DRE順式作用元件，并調(diào)控抗逆相關(guān)功能基因的表達，從而提高植物對環(huán)境的耐受性。

Medina等[8]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥CBF基因家族成員AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因只對低溫產(chǎn)生了響應，對干旱和ABA沒有反應。對辣椒CaCBF1A和CaCBF1B研究發(fā)現(xiàn)，低溫情況下，這2個基因受誘導表達；而如果長期持續(xù)低溫，這2個基因會一直表達，CaCBF1A上調(diào)10～15倍[9]。

秦紅霞等[10]研究了銀新楊轉(zhuǎn)錄因子PaDREB2的表達模式，發(fā)現(xiàn)其表達受低溫、干旱和鹽脅迫的誘導。通過轉(zhuǎn)錄組分析及突變試驗研究低溫脅迫下擬南芥基因表達情況，結(jié)果表明，CBF2能夠誘導44個基因上調(diào)，其中有25個基因至少上調(diào)15倍[11]。Wang等[12]研究檸條錦雞兒CkCBF基因，發(fā)現(xiàn)其在低溫、干旱、高鹽及ABA等逆境條件下表達量上調(diào)；在煙草中超量表達該基因，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，其提高了植株的耐鹽性和滲透力。周洲等[13]對毛白楊轉(zhuǎn)錄因子PtCBF5在逆境下的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，其在低溫和干旱脅迫下表達量有顯著變化，而對高鹽和ABA脅迫沒有反應。將甜椒(Capsicumfrutescens)CfCBF3基因轉(zhuǎn)到煙草中，結(jié)果表明，在冷脅迫下，CfCBF3急速上調(diào)；而在鹽脅迫及干旱脅迫下，該基因誘導差異不顯著[14]。將南極發(fā)草DaCBF7基因轉(zhuǎn)到水稻中，逆境脅迫后分析表明，該基因大大提升了轉(zhuǎn)基因植株耐低溫脅迫能力，而對干旱及鹽脅迫作用不大[15]。

本試驗通過同源克隆的方法從辣椒基因組中克隆到CaCBF1A基因(CA03g15650)，并利用生物信息學軟件對其編碼氨基酸序列進行了分析，該基因具有一個完整的ORF(471 bp)，編碼156個氨基酸。CaCBF1A編碼的蛋白質(zhì)包含保守的AP2 DNA結(jié)合域。對其亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)進行分析，預測其定位在葉綠體中，存在跨膜結(jié)構(gòu)。進一步研究了辣椒CaCBF1A基因?qū)Φ蜏孛{迫、高溫脅迫和鹽脅迫的響應。對脅迫環(huán)境下其相對表達量的分析表明，隨著脅迫處理時間的延長，其表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。由于CBF轉(zhuǎn)錄因子在許多與抗逆相關(guān)功能基因的表達中發(fā)揮重要作用，因此，利用CBF基因增強植物抗逆性成為改良植物的重要途徑。

[1] Glazebrook J.Genes controlling expression of defense responses inArabidopsis[J].Plant Biology,2001,4(4):301-308.

[2] Rushton P J,Somssich I E.Transcriptional control of plant genes responsive to pathogens[J].Plant Biology,1998,4:311-315.

[3] Chen W,Provart N J,Glazebrook J，etal.Expression profile matrix ofArabidopsistranscription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses[J].The Plant Cell,2002,3(14):559-574.

[4] Yang T W,Zhang L J,Zhang T G,etal.Transcriptional regulation network of cold-responsive genes in higher plants[J].Plant Science,2005,169:987-995.

[5] Thomashow M F.Molecular basis of plant cold acclimation:Insights gained from studying the CBF cold response pathway[J].Plant Physiol,2010,154(2):571-577.

[6] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[7] Sieber A N,Longin C F,Leiser W L,etal.Copy number variation of CBF-A14 at the Fr-A2 locus determines frost tolerance in winter durum wheat[J].Theor Appl Genet,2016,129(5):1-11.

[8] Medina J,Bargues M,Terol J,etal.TheArabidopsisCBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration[J].Plant Physiol,1999,119(2):463-469.

[9] Kim S,An C S,Hong Y N,etal.Cold-inducible transcription factor,CaCBF,is associated with a homeodomain leucine zipper protein in hot pepper(CapsicumannuumL.)[J].Mol Cells,2004,18(3):300-308.

[10] 秦紅霞,賈志平,張海超,等.銀新楊中與DRE元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的克隆及鑒定分析[J].生物工程學報，2005,21(6):906-910.

[11] Vogel J T,Zarka D G,Van Buskirk H A,etal.Roles of theCBF2 andZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome ofArabidopsis[J].Plant J,2005,41(2):195-211.

[12] Wang X M,Dong J,Liu Y,etal.A novel dehydration-responsive element-binding protein fromCaraganakorshinskiiis involved in the response to multiple abiotic stresses and enhances stress tolerance in transgenic tobacco[J].Plant Mol Biol Rep,2010,28(4):664-675.

[13] 周洲,李永麗.毛白楊轉(zhuǎn)錄因子PtCBF5的表達模式分析[J].林業(yè)科學,2010,46(4):58-63.

[14] Yang S,Tang X F,Ma N N,etal.Heterology expression of the sweet pepperCBF3 gene confers elevated tolerance to chilling stress in transgenic tobacco[J].J Plant Physiol,2011,168(15):1804-1812.

[15] Byuna M Y,Leeb J,Cuia L H,etal.Constitutive expression ofDaCBF7,an antarctic vascular plantDeschampsiaantarcticaCBF homolog,resulted in improved cold tolerance in transgenic rice plants[J].Plant Science,2015,236:61-74.

Cloning and Expression Analysis ofCaCBF1AGene fromCapsicumannuumL.under Abiotic Stress

WEI Xiaochun1,LI Yan2,YAO Qiuju1,YUAN Yuxiang1,ZHAO Yanyan1,WANG Zhiyong1,JIANG Jun2,DUAN Junzhi3,JIANG Wusheng1,ZHANG Xiaowei1*

(1.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhumadian Institute of Agricultural Sciences,Zhumadian 463000,China;3.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To reveal the roles ofCaCBF1Agene played in pepper,theCaCBF1Agene was cloned and analyzed.According to the CBF gene sequence fromCapsicumannuumgenome,the primer was designed.Yujiao 101 was taken as material andCaCBF1Awas acquired from the genome of pepper by PCR.The bioinformatics analysis results indicated that the gene possessed complete ORF with length of 471 bp,encoding 156 amino acids.Protein encoded byCaCBF1Agene in pepper contained conservative AP2 DNA binding domain.Besides,the subcellular localization and membrane structure were analyzed.It was predicted that protein encoded byCaCBF1Awas located in chloroplasts,and contained transmembrane structure.Furthermore,the results by fluorescence quantitative PCR showed that cold,high temperature and salt stress could induce the expression ofCaCBF1Agene,the expression level of which was decreased rapidly after peak point.These could provide some indication thatCaCBF1Awas rapid response gene,which played important roles in the resistance mechanisms of pepper.

CapsicumannuumL.; CBF gene; gene cloning; abiotic stress; expression analysis

2016-07-20

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系豫北綜合試驗站項目(CARS-25-G-27)；河南省重大科技專項(151100110400)

魏小春(1983-)，男，河南項城人，助理研究員，博士，主要從事植物生理與分子生物學研究。 E-mail:jweixiaochun@126.com

*通訊作者：張曉偉(1965-)，男，河南平輿人，研究員，碩士，主要從事蔬菜育種與分子生物學研究。

時間：2016-11-25 14∶24∶33

S641.3

A

1004-3268(2016)12-0110-06

網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.028.html