智亞楠，陳月華，馬宇明，尹 健，陳利軍*

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.豫南植物有害生物綠色防控院士工作站，河南 信陽 464000)

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河南省黃花蒿揮發(fā)油的組分分析及抑菌作用測定

智亞楠1,2，陳月華1，馬宇明1，尹 健1,2，陳利軍1,2*

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.豫南植物有害生物綠色防控院士工作站，河南 信陽 464000)

為了明確河南省黃花蒿揮發(fā)油的成分和抑菌活性，采用水蒸氣蒸餾法提取采自河南信陽的黃花蒿揮發(fā)油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)進行組分分析，并測定揮發(fā)油的熏蒸抑菌作用。結(jié)果表明：從黃花蒿揮發(fā)油中共分離到28個組分，鑒定出其中24個，占揮發(fā)油總量的95.324%，其主要組分為蒿酮(46.654%)、桉油精(13.422%)、樟腦(9.648%)等；揮發(fā)油對水稻紋枯病菌、番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌和油菜菌核病均有強烈的熏蒸抑制作用，有效中濃度(EC50)分別為0.78 μL/皿、0.89 μL/皿、1.32 μL/皿和1.52 μL/皿。說明河南省黃花蒿揮發(fā)油可在農(nóng)業(yè)上作為殺菌劑使用，具有一定的開發(fā)價值。

黃花蒿； 揮發(fā)油； 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法； 抑菌作用

黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn)又名黃蒿、臭蒿、苦蒿等，為菊科(Asteraceae)蒿屬(Artemisia)1年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的中草藥，全株具有濃烈的揮發(fā)性氣味，其廣泛分布于國內(nèi)各省，在河南信陽也是一種常見的野生植物[1]。黃花蒿的化學(xué)成分豐富，可分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性2類。非揮發(fā)性成分的代表是青蒿素[2]，該成分已在醫(yī)學(xué)界引起高度關(guān)注，并被開發(fā)為多種藥品，用于治療瘧疾、腫瘤、低熱、結(jié)核病等[3-5]。揮發(fā)性成分包括脂肪族化合物，芳香族化合物，萜類化合物中的單萜、倍半萜及其含氧衍生物。多項研究表明，黃花蒿揮發(fā)油具有殺蟲[6-9]、殺螨[10-11]、抑菌[12-16]、抑制植物生長[17-18]、果蔬保鮮等生物活性[19]。不同地區(qū)的黃花蒿揮發(fā)油的化學(xué)組分、含量和生物活性有較大差異，已有學(xué)者對石家莊[20]、湘西[21]、陜北[22]、山東[23]等地區(qū)黃花蒿的揮發(fā)油成分進行了報道，而關(guān)于信陽地區(qū)黃花蒿揮發(fā)油的組分及活性研究尚未見報道。為了掌握河南信陽黃花蒿揮發(fā)油的含量、組分及抑菌活性，采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿的揮發(fā)油，測定其含油率，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析揮發(fā)油的化學(xué)組分，并以番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)4種常見病原菌為目標(biāo)菌，測定揮發(fā)油對病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，以明確黃花蒿在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)利用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 黃花蒿 供試黃花蒿全草于2015年8月下旬采自信陽市震雷山，選取健康、生長旺盛的植株，室內(nèi)自然風(fēng)干后，剪為不超過0.5 cm的小段。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 000 mL。

1.1.3 植物病原真菌 番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌和水稻紋枯病菌菌株由信陽農(nóng)林學(xué)院植物病理實驗室分離保存。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 包括Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)、NIST05譜庫、HP-250S生化培養(yǎng)箱(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)、電子天平、KDM-2000電熱套(金壇市恒豐儀器制造有限公司)、鐵架臺、冷凝管、圓底燒瓶等。

1.2 黃花蒿揮發(fā)油的提取

準(zhǔn)確稱量植物材料，采用水蒸氣蒸餾法連續(xù)提取2 h，得透明的淡黃色具濃郁氣味的油狀液體，即揮發(fā)油，將揮發(fā)油密封好，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。計算含油率，重?fù)3次。含油率=揮發(fā)油體積/樣品質(zhì)量×100%。

1.3 揮發(fā)油熏蒸抑菌作用測定

揮發(fā)油對植物病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用采用參考文獻[24]的生長速率法測定，根據(jù)揮發(fā)油的使用劑量設(shè)7個處理，每皿分別為0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL、5.0 μL、10.0 μL，以僅放一濾紙片不滴加揮發(fā)油為對照，重復(fù)3次。48 h后觀察植物病原真菌的生長情況，并采用十字交叉法測量病原真菌菌落直徑，取其平均值，計算抑制率。抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%。

利用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立毒力回歸方程，求得相關(guān)系數(shù)、有效中濃度(EC50)及其置信區(qū)間，并根據(jù)EC50值比較揮發(fā)油對不同病原真菌的毒力。

1.4 揮發(fā)油GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫,起始柱溫60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫速率升至230 ℃，保持20 min，進樣口溫度和接口溫度分別為230 ℃和150 ℃；載氣為高純氦氣，柱流速為1.0 mL/min，揮發(fā)油用乙醚稀釋100倍，進樣量1.0 μL，不分流。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍30～350 amu，四級桿溫度和離子源溫度分別為230 ℃和150 ℃，EM電壓1 729 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿中揮發(fā)油的含油率

經(jīng)計算，采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿揮發(fā)油的含油率為0.46%。

2.2 黃花蒿揮發(fā)油組分GC-MS分析

對黃花蒿的揮發(fā)油組分進行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對，并結(jié)合化學(xué)物質(zhì)登錄號(CAS號)分析，從黃花蒿揮發(fā)油中共分離出28個組分，其中鑒定出了24個組分(表1)，占總成分的95.324%。從表1可以看出，黃花蒿揮發(fā)油中相對含量最高的組分為蒿酮(46.654%)，其次為桉油精(13.422%)和樟腦(9.648%)，再次為3,3,6-三甲基-1,5-庚二烯-4-醇(4.076%)、石竹烯氧化物(2.636%)、石竹烯(2.515%)等。

2.3 黃花蒿揮發(fā)油對病原真菌的熏蒸抑制作用

黃花蒿揮發(fā)油對4種植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用測定結(jié)果見圖2—3、表2。從表2可以看出，黃花蒿揮發(fā)油對供試菌種菌絲生長均有一定的熏蒸抑制作用，抑制作用隨劑量增加而增強。在2.0 μL/皿的較低劑量下，揮發(fā)油對4種病原菌的抑制率均在50%以上，其中對水稻紋枯病菌的抑制率最高，達到70.67%。10.0 μL/皿的劑量對番茄灰霉病菌的抑制率達到99.13%，對其他3種病原菌的抑制率也在90%以上，抑菌效果較好。

圖1 黃花蒿揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

峰號保留時間/min化合物分子式相對含量/%13.787未鑒定-0.48625.488(1S)-2,2-二甲基-3-亞甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚烷C10H161.05735.877β-水芹烯C10H160.66945.949β-蒎烯C10H160.83456.115β-月桂烯C10H160.67166.2303,3,6-三甲基-1,4-庚二烯-6-醇C10H18O1.70776.828桉油精C10H18O13.42287.318蒿酮C10H16O46.65497.426(1α,2β,5α)-2-甲基-5-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3.1.0]正己烷-2-醇C10H18O0.530107.6213,3,6-三甲基-1,5-庚二烯-4-醇C10H18O4.076117.880未鑒定-1.926128.5142-甲基-6-亞甲基-1,7-辛二烯-3-酮C10H14O0.843138.680樟腦C10H16O9.648148.7522,6-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇C10H16O1.262158.9476,6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚烷-3-酮C10H14O0.515168.976未鑒定-0.518179.1484-萜烯醇C10H18O1.302189.4296,6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇C10H16O0.6331912.052α-蓽澄茄油烯C15H241.3462012.1242-甲基丁酸苯甲酯C12H16O20.9922112.686石竹烯C15H242.5152213.047金合歡烯C15H240.5442313.501大根香葉烯DC15H241.1022413.580[4aR-(4aα,7α,8aβ)]-十氫-4a-甲基-1-亞甲基-7-(1-甲基乙烯基)-萘C15H240.4992514.877石竹烯氧化物C15H24O2.6362615.309雪松醇C15H26O0.6562715.5832,4-二甲基-苯甲醇C9H12O1.2112816.289未鑒定-1.746

對于每種病菌，第1排從左至右揮發(fā)油劑量依次為0(對照)、0.5、1.0、1.5 μL/皿，第2排從左至右劑量依次為2.0、2.5、5.0、10.0 μL/皿，下同

圖3 黃花蒿揮發(fā)油對油菜菌核病菌(A)和水稻紋枯病菌(B)的熏蒸抑制作用

揮發(fā)油劑量/(μL/皿)抑制率/%番茄灰霉病菌小麥赤霉病菌油菜菌核病菌水稻紋枯病菌0.540.6036.2128.8744.521.052.7140.9342.0254.061.558.4844.9147.1861.482.069.4356.2350.2370.672.576.0762.6356.1078.805.093.6685.0579.5888.3410.099.1391.4693.6697.17

表3結(jié)果顯示，黃花蒿揮發(fā)油對植物病原真菌菌絲生長均有強烈的熏蒸抑制作用。從EC50分析，揮發(fā)油對水稻紋枯病菌的抑制作用最強，EC50僅為0.78 μL/皿，其次是番茄灰霉病菌，EC50為0.89 μL/皿，揮發(fā)油對小麥赤霉病菌和油菜菌核病菌的抑制作用相對較弱，EC50分別為1.32 μL/皿和1.52 μL/皿。

表3 黃花蒿揮發(fā)油對植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

多項研究顯示，不同地區(qū)的黃花蒿揮發(fā)油組分和含量存在差異[20-23]，本試驗通過GC-MS從信陽產(chǎn)的黃花蒿揮發(fā)油中分離到28個組分，鑒定出了其中的24個組分，主要為蒿酮、桉油精、樟腦等。據(jù)報道，石家莊野生黃花蒿揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為蒿酮、右旋樟腦和石竹烯[20]，湘西黃花蒿揮發(fā)油的主要組分為杜松醇、脫氧青蒿素、1H-環(huán)丙烷萘、1,3-二氧雜環(huán)己烷-4,6-二酮、α-愈創(chuàng)木烯等[21]，陜北產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)油的主要組分為(-)-斯巴醇、石竹烯氧化物和視黃醛[22]。本研究結(jié)果顯示，信陽產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)油主要組分與石家莊產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)油主要組分較為接近，與湘西、陜北產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)油差異較大。蒿酮、桉油精、樟腦、石竹烯等化合物在生活中常被用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品生產(chǎn)中，在農(nóng)用上開發(fā)利用較少[25-28]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，信陽地區(qū)的黃花蒿揮發(fā)油對供試的4種植物病原真菌均有強烈的熏蒸抑制作用，其中對水稻紋枯病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用較強，EC50僅為0.78 μL/皿和0.89 μL/皿。有學(xué)者[14]采用抑菌圈法和孢子萌發(fā)法測定了黃花蒿不同溶劑提取物對青霉、綿霉和黑曲霉的抑菌活性，結(jié)果顯示，黃花蒿不同溶劑提取物對3種病原菌都有一定的抑制作用?？梢?，黃花蒿揮發(fā)油中含有某些抑菌活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能抑制病原菌菌絲的生長或者孢子的萌發(fā)。

黃花蒿揮發(fā)油對植物病原真菌的抑制作用可能是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，單體組分在抑菌活性中發(fā)揮的作用，有待進一步研究，進而可找到抑菌活性高的化合物。從植物提取物中尋找有生物活性的物質(zhì)是開發(fā)、研制新型農(nóng)藥的有效途徑之一，可以對揮發(fā)油中活性物質(zhì)進行分離、篩選，直接作為植物源農(nóng)藥；也可以以活性物質(zhì)為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)改造，合成新的化學(xué)農(nóng)藥。黃花蒿在全國極為常見，且易于人工栽培，是一種理想的植物源農(nóng)藥來源，以其為原料進行植物源抗菌劑的開發(fā)，將具有廣闊的前景和深遠的意義。

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The Chemical Constituents and Antifungal Activity of Essential Oil fromArtemisiaannuaLinn in Henan Province

ZHI Ya’nan1,2,CHEN Yuehua1,MA Yuming1,YIN Jian1,2,CHEN Lijun1,2*

(1.Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China; 2.Academician Workstation of Pest Green Prevention and Control for Plants in Southern Henan,Xinyang 464000,China)

In order to determine the chemical constituents and antifungal activity of essential oil fromArtemisiaannuaLinn,essential oil fromA.annuaLinn in Xinyang city of Henan province was extracted by steam distillation,and their chemical constituents were analyzed by GC-MS.The antifungal activity of essential oil was also studied.The results showed that 28 ingredients were found,and 24 of them were identified，accounting for 95.324% of the total essential oil fromA.annuaLinn.The main chemical constituents were artemisia ketone(46.654%),eucalyptol(13.422%),camphor(9.648%),etc.The essential oil showed strong fumigation antifungal effect onRhizoctoniasolani,Botrytiscinerea,FusariumgraminearumandSclerotiniasclerotiorum,and the EC50values were 0.78 μL/dish,0.89 μL/dish,1.32 μL/dish and 1.52 μL/dish,respectively.The essential oil can be used as a fungicide in agriculture and possesses a certain developing value.

ArtemisiaannuaLinn; essential oil; GC-MS analysis; antifungal activity

2016-05-28

國家自然科學(xué)基金項目(31401798)；河南省科技攻關(guān)項目(122102310257)

智亞楠(1985-)，女，河南漯河人，助教，碩士，主要從事植物病理學(xué)和農(nóng)藥學(xué)的教學(xué)和研究工作。 E-mail：zhiyanan000@126.com

*通訊作者：陳利軍(1980-)，男，河南濟源人，副教授，碩士，主要從事植物病理學(xué)和真菌學(xué)的教學(xué)和研究工作。 E-mail:chlijun1980@163.com

時間：2016-11-25 14∶24∶33

S476

A

1004-3268(2016)12-0105-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.021.html