?；燮?邢文會,夏鐵騎,楊 雪,付瑞敏,王 丁,張 紅*

(1.河南教育學院 生命科學系,河南 鄭州 450046; 2.濮陽職業(yè)技術(shù)學院,河南 濮陽 457000)

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根際促生細菌的篩選及其對小麥幼苗的促生作用

?；燮?,邢文會1,夏鐵騎2,楊 雪1,付瑞敏1,王 丁1,張 紅1*

(1.河南教育學院 生命科學系,河南 鄭州 450046; 2.濮陽職業(yè)技術(shù)學院,河南 濮陽 457000)

為了獲得小麥根際促生菌，從小麥根際土壤中分別篩選具有固氮、解磷、解鉀能力的菌株,測定其生長性能及與病原菌(小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌)的拮抗作用，對其進行生理生化及分子鑒定，并評價其對小麥幼苗的促生作用，以期為小麥復(fù)合微生物肥料的研制提供優(yōu)良的菌株資源。結(jié)果表明,通過透明圈法初篩到透明圈較大的固氮細菌8株、解鉀細菌8株、解無機磷細菌4株、解有機磷細菌4株。根據(jù)菌株產(chǎn)IAA、溶磷能力較高且產(chǎn)NH3、HCN或者鐵載體的能力,篩選出8株細菌,分別與3種病原菌進行拮抗試驗,復(fù)篩到HN1202、HK1216、HP1218三株細菌可以同時拮抗3種病原菌,且彼此之間沒有拮抗反應(yīng)。對3株菌的菌落特征、菌體形態(tài)及生理生化特性進行研究,結(jié)合菌株的16S rDNA序列分析,初步確定HN1202和HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),HK1216為芽孢桿菌屬(Bacillus)。分別用HN1202、HP1218、HK1216菌液對小麥種子進行浸種處理,小麥幼苗根長分別較對照(無菌液處理)顯著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分別較對照顯著增加11.8%、13.2%、8.8%,萌發(fā)5條根和6條根的比例均較對照顯著增加。綜上，篩選的小麥根際促生細菌可作為復(fù)合微生物肥料的功能菌株。

根際促生細菌; 篩選; 鑒定; 小麥幼苗; 促生作用

農(nóng)業(yè)是我國的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè),在國民經(jīng)濟中一直占據(jù)著重要位置?；适潜Ｕ霞Z食增產(chǎn)的重要因素,我國以占世界8%的耕地消耗了世界30%以上的化肥,長期過量施用化肥帶來了環(huán)境污染、土壤板結(jié)、地力衰退、生態(tài)惡化和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題[1]。微生物肥料又稱生物肥料、菌肥、接種劑,是一類以微生物生命活動及其產(chǎn)物使農(nóng)作物得到特定肥效的微生物活體制品[2],具有環(huán)境友好、節(jié)約資源、綠色安全等特點。生產(chǎn)實踐證明,微生物肥料在提升耕地土壤肥力、維持耕地土壤結(jié)構(gòu)、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)方面發(fā)揮著巨大的潛力,在國家耕地質(zhì)量提升的需求中具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。

微生物肥料的核心是特定的有效菌種,所以篩選性能優(yōu)良的菌株是微生物肥料研制的關(guān)鍵。植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)指生存于植物根際、根表,并能直接或間接地促進或調(diào)節(jié)植物生長的微生物[4]。根際微生物研究的最終目標是充分利用根際微生物資源,促進植物生長、保持植物健康、減少農(nóng)用化學品的投入,從而促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[5]。從多種植物根際土壤中均可分離到PGPR菌株,如Zhang等[6]從煙草根際土壤中分離到洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)及產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)等,郭芳芳等[7]和馬菁華等[8]分別從柳杉、西瓜根際土壤中分離到多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),胡春錦等[9]從甘蔗根際土壤中分離到假單胞菌屬(Pseudomonas)及芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌,陳波等[10]從櫻桃根際土壤中分離到產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)及腸桿菌屬(Enterobacter)細菌,韓華雯等[11]從小麥和苜蓿根際土壤中分離到根瘤菌屬(Rhizobium)和固氮菌屬(Azotobacter)細菌,鄭文波等[12]從花生根際土壤中分離到巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),袁輝林等[13]從紅樹林根際土壤中分離到克雷伯氏菌屬(Klebsiella)細菌。目前已發(fā)現(xiàn)20多個屬的細菌具有促生防病潛能,其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬最多。已報道的具有促生作用的PGPR種類雖然較多,但應(yīng)用范圍廣和適應(yīng)能力強的菌種仍然較少[14],PGPR優(yōu)良菌株的篩選以及復(fù)合菌劑的研發(fā)與應(yīng)用是目前生物肥料研究領(lǐng)域的熱點之一,因而如何獲得高效的PGPR菌株依然是當前研制高效生物肥料的關(guān)鍵。本研究根據(jù)PGPR的促生長指標如產(chǎn)植物生長素(IAA)、HCN、鐵載體能力以及解磷、拮抗病原菌能力等從小麥根際土壤中篩選PGPR菌株,并研究其對小麥幼苗的促生作用,為微生物資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤及小麥 土壤樣品采自鄭東新區(qū)小麥田,取 0～20 cm土層的根系(帶土)樣品,保存于無菌紙袋中帶回實驗室。供試小麥種子為新麥26。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[15]、PDA培養(yǎng)基[15]、Ashby培養(yǎng)基[16]、解鉀細菌培養(yǎng)基[16]、PKO無機磷培養(yǎng)基[17]、蒙金娜有機磷培養(yǎng)基[17]、MM培養(yǎng)基[18]、CAS檢測培養(yǎng)基[19-21]、Hoagland半固體培養(yǎng)基[22]及NB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20 g,pH值7.2),所用緩沖液為磷酸鹽(PBS)緩沖液[23]。

1.2 方法

1.2.1 小麥根際土壤懸液的制備 抖落小麥根系上較大的土壤顆粒,剪切為約3 cm的根段,混合各根段。稱取10 g置于含有 90 mL無菌水的三角瓶中,充分振蕩,即為小麥根際土壤懸液,將土壤懸液10 倍梯度稀釋,制成10-1～10-7土壤稀釋液。

1.2.2 小麥PGPR的初篩 分別取10-3～10-7土壤稀釋液0.1 mL,均勻涂布到Ashby培養(yǎng)基、解鉀細菌培養(yǎng)基、PKO無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上初篩具有固氮、解磷、解鉀的菌株。經(jīng)28 ℃培養(yǎng)5～7 d,挑取透明圈較大的單菌落,經(jīng)多次傳代培養(yǎng),選取長勢較好的菌株保存。

1.2.3 小麥PGPR的復(fù)篩 根據(jù)初篩菌株的促生長特性進行復(fù)篩。

1.2.3.1 產(chǎn)IAA能力 IAA標準曲線的繪制:稱取IAA的標準品,用雙蒸水分別配制10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L溶液,并測定各質(zhì)量濃度溶液的OD530值,繪制IAA的標準曲線[24]。

將初篩菌株接種于MM液體培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 d,取培養(yǎng)液離心得上清液。取1 mL上清液加入 2 mL Salkowski’s 反應(yīng)液(10.8 mol/L H2SO4溶液、4.5 g/L FeCl3),暗處25 ℃混合反應(yīng) 30 min。測定混合反應(yīng)液OD530值,以空白培養(yǎng)基作為對照。根據(jù)IAA的標準曲線,計算菌株產(chǎn)生IAA的量[24]。

1.2.3.2 產(chǎn)NH3能力 將初篩菌株接種到含10 mL10 g/L蛋白胨溶液的試管中,28 ℃培養(yǎng)2～3 d,每管加入0.5 mL Nessler’s試劑,觀察液體顏色的變化,液體由褐色變?yōu)辄S色表明菌株具有產(chǎn)生NH3的能力。

1.2.3.3 產(chǎn)HCN能力 將初篩菌株劃線接種于含有4.4 g/L甘氨酸的NB培養(yǎng)基中,同時將浸過2%碳酸鈉、0.5% 2,4,6-三硝基苯酚溶液的濾紙平鋪于培養(yǎng)基上,密封,28 ℃培養(yǎng)4 d,觀察濾紙顏色的變化,濾紙由橘黃色變?yōu)榧t色說明該菌株具有產(chǎn)生HCN的能力。

1.2.3.4 產(chǎn)鐵載體能力 將初篩菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,用滅菌的牙簽將菌種點接在CAS固體檢測平板上,每皿3個接種點,28 ℃培養(yǎng)2 d。觀察菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈,以判斷是否具有產(chǎn)鐵載體的能力[20-21]。

1.2.3.5 解磷能力 將初篩菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,按照1%的接種量接種到液體PKO培養(yǎng)基(或蒙金娜有機磷培養(yǎng)基)中,于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d,并在4 ℃、10 000 r/min離心20 min,采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量[19,25]。

1.2.3.6 拮抗病原菌能力 采用平板對峙法測定初篩菌株與病原菌的拮抗作用。將小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)接種到PDA平板上,25 ℃培養(yǎng)5～7 d。初篩菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。再將病原菌與初篩菌株同時接種在PDA平板上,平板中心接種病原菌菌餅(直徑為5～6 mm)，距中心約3 cm處,滴加初篩菌株懸液。25 ℃培養(yǎng)3～5 d,記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點樣中心點到被初篩菌株抑制的邊緣的半徑(r)，計算抑制率,抑制率=(R-r)/R×100%[26]。

1.2.4 小麥PGPR菌株的形態(tài)特征及生理生化特性測定 對篩選的菌株間進行拮抗試驗,對無拮抗反應(yīng)的菌株進行組合,作為復(fù)合微生物肥料的功能菌株。并對篩選所得菌株的菌落特征、菌體形態(tài)、染色性及生理生化特性進行研究,依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行鑒定[27]。

1.2.5 小麥PGPR菌株的分子鑒定 提取HN1202、HK1216、HP1218三株菌的總DNA,采用PCR擴增細菌的16S rDNA基因序列。PCR擴增上游引物8f 序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物1541r 序列為5′-AAGGAGGTGATCCANCCRCA-3′。PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min[18]。純化獲得的PCR產(chǎn)物送至微基生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST序列比對。使用MEGA 6.0軟件,采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 小麥PGPR菌株對小麥幼苗的促生作用測定 將篩選的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)后期或穩(wěn)定期,用PBS緩沖液洗滌菌體2～3次并稀釋至菌液濃度約為1×108cfu/mL。選取飽滿、均勻一致的小麥種子,用蒸餾水沖洗干凈并浸泡4 h,然后移至75%乙醇中處理1 min,無菌水清洗后,再用5%的NaClO溶液浸泡5 min,無菌水清洗,進行種子表面消毒。將消毒的小麥種子置于培養(yǎng)皿中,25 ℃暗處萌發(fā)2 d。挑選萌發(fā)的健壯的小麥種子浸入菌液中,25 ℃吸附1 h,播種于Hoagland半固體培養(yǎng)基中,于人工智能培養(yǎng)箱中(14 h 光照/10 h 黑暗,相對濕度40%～50%)25 ℃培養(yǎng)10 d。將萌發(fā)的小麥種子浸泡在PBS緩沖液中作為空白對照,培養(yǎng)條件同接種菌液處理。第10天測量幼苗的根長與株高,并統(tǒng)計萌發(fā)的根數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥PGPR菌株的初篩結(jié)果

在Ashby培養(yǎng)基、解鉀細菌培養(yǎng)基、PKO無機磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機磷培養(yǎng)基平板上分別涂布小麥根際土壤稀釋液,28 ℃培養(yǎng),挑取有透明圈的固氮細菌20株、解鉀細菌20株、解無機磷細菌12株、解有機磷細菌12株,各菌株再經(jīng)多次傳代,最終選取長勢較好、透明圈較大的固氮細菌8株(HN1201—1208)、解鉀細菌8株(HK1209—1216)、解無機磷細菌4株(HP1217—1220)、解有機磷細菌4株(HP1221—1224)。

2.2 小麥PGPR菌株的復(fù)篩結(jié)果

對長勢較好的8株固氮細菌、8株解鉀細菌、4株解無機磷細菌、4株解有機磷細菌進行生長性能的測定,結(jié)果見表1。根據(jù)菌株可產(chǎn)IAA、解磷能力較高,且具有產(chǎn)NH3、HCN或者鐵載體的能力,篩選出HN1202、HN1206、HK1215、HK1216、HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株(表1),與病原菌進行拮抗作用試驗。

表1 小麥PGPR菌株的促生長性能測定結(jié)果

注：-表示陰性，+表示陽性，下同。

將篩選出的8株菌分別與小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌進行拮抗作用試驗,結(jié)果見表2。根據(jù)表2可知,對3種病原菌均有抑制能力的菌株為HN1202、HK1216、HP1218、HP1223。

2.3 小麥PGPR菌株的菌落形態(tài)特征及部分生理生化特性

對復(fù)篩獲得的HN1202、HK1216、HP1218、HP1223進行菌株間的拮抗反應(yīng)測定,發(fā)現(xiàn)HN1202、HK1216、HP1218彼此之間不發(fā)生拮抗反應(yīng)。對3個菌株的菌落特征、形態(tài)特征及生理生化特性進行研究(表3)發(fā)現(xiàn),HN1202和HK1216菌落為乳白色、邊緣有缺刻,HP1218菌落淡黃色、邊緣整齊;3株菌均為桿狀，均具有鞭毛。HN1202和HP1218為革蘭氏陰性菌,不產(chǎn)芽孢,能發(fā)酵葡萄糖、利用甘露醇,吲哚、甲基紅試驗陰性，接觸酶、氧化酶、過氧化氫酶試驗均為陽性。另外，HN1202能液化明膠、還原硝酸鹽,V-P反應(yīng)陽性；HP1218能水解淀粉、利用檸檬酸鹽，V-P反應(yīng)陰性。HK1216為革蘭氏陽性菌,產(chǎn)芽孢,能發(fā)酵葡萄糖、水解淀粉、液化明膠,吲哚試驗陰性、V-P反應(yīng)陰性、甲基紅試驗陽性，接觸酶、過氧化氫酶試驗陽性，可還原硝酸鹽、利用甘露醇。

表2 小麥PGPR菌株對病原菌的抑菌率 %

表3 小麥PGPR菌株的菌落形態(tài)特征及部分生理生化特性

2.4 小麥PGPR菌株的初步鑒定

對HN1202、HK1216、HP1218菌株的16S rDNA基因序列進行比對分析發(fā)現(xiàn),HP1218與假單胞菌S2(Pseudomonassp.)的同源性高達99%,HN1202與假單胞菌K1(Pseudomonassp.)同源性高達99%，HK1216與芽孢桿菌Y8(Bacillussp.)的同源性高達99%。結(jié)合HN1202、HK1216、HP1218菌落形態(tài)、生理生化特性及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹(圖1)初步確定,HN1202和HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),HK1216為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

圖1 采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.5 小麥PGPR菌液浸種對小麥幼苗的促生長作用

HN1202、HP1218、HK1216浸種處理小麥幼苗根長分別為11.6、12.4、12.1 cm,分別較對照顯著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分別為15.2、15.4、14.8 cm,分別較對照顯著增加11.8%、13.2%、8.8%(圖2)。HN1202、HP1218、HK1216浸種處理萌發(fā)5條根的小麥種子所占比例分別為33.4%、35.5%、33.7%,均顯著高于對照(31.6%);萌發(fā)6條根的小麥種子所占比例分別為11.3%、13.5%、11.6%,均顯著高于對照(9.4%)(圖3),表明菌株HN1202、HP1218、HK1216對小麥種子幼苗生長和生根均有明顯的促進作用。

*表示與CK差異顯著(P<0.05),下同

圖3 小麥PGPR浸種對小麥幼苗萌發(fā)根數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

本研究通過透明圈法初篩到透明圈較大的固氮細菌8株、解鉀細菌8株、解無機磷細菌4株、解有機磷細菌4株。根據(jù)菌株產(chǎn)IAA、溶磷能力較高且產(chǎn)NH3、HCN或者鐵載體的能力,篩選出8株細菌,分別與3種病原菌進行拮抗試驗,復(fù)篩到HN1202、HK1216、HP1218三株細菌可以同時拮抗3種病原菌(小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌)且彼此之間沒有拮抗反應(yīng)。對3株菌的菌落特征、菌體形態(tài)及生理生化特性進行研究,結(jié)合菌株的16S rDNA序列分析,初步確定HN1202和HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),HK1216為芽孢桿菌屬(Bacillus)。分別用HN1202、HP1218、HK1216菌液對小麥種子進行浸種處理,小麥幼苗根長分別較對照(無菌液處理)顯著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分別較對照顯著增加11.8%、13.2%、8.8%,萌發(fā)5條根和6條根的比例均較對照顯著增加。本研究篩選的3株細菌具有多種促生機制,具有較大的應(yīng)用潛力,但需要進行菌株組合，然后通過大田試驗進一步研究。

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Screening of Plant Growth-promoting Rhizobacteria and Their Growth-promoting Effect on Wheat Seedling

CHANG Huiping1,XING Wenhui1,XIA Tieqi2,YANG Xue1,FU Ruimin1,WANG Ding1,ZHANG Hong1*

(1.Department of Life Sciences,Henan Institute of Education,Zhengzhou 450046,China;2.Puyang Vocational and Technical College,Puyang 457000,China)

In order to obtain plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR),some strains with nitrogen-fixing,potassium-dissoloving and phosphorus-dissoloving abilities were isolated from rhizosphere soil of wheat,after identifying these strains through phenotypic,physiological,biochemical and phylogenetic characterization,both their growth performance and antagonistic capability against three kinds of plant pathogens which respectively caused fusarium head blight (FHB),wheat sharp eyespot(WSE) and rice sheath blight (RSB) were tested,and their growth-promoting effects on wheat seedling were evaluated,so as to provide excellent strains for the production of functional microbial fertilizers.The results showed that the preliminary screening was carried out by using the transparent zone method and eight strains of nitrogen-fixing bacteria,eight strains of potassium-dissoloving bacteria,four strains of inorganic phosphorus-dissoloving bacteria and four strains of organophosphorus-dissoloving bacteria were picked out.The further screening was carried out by testing their ability of solubilizing phosphorus and producing IAA,NH3,HCN and siderophore,and eight strains were picked out.After testing their antagonistic capability against three kinds of plant pathogens,three rhizosphere strains (HN1202,HK1216,HP1218) with significant antagonistic ability against pathogens and without antagonism between each other were screened,and respectively identified through phenotypic,physiological,biochemical and phylogenetic(16S rDNA) characterization.After primary identification,both strain HN1202 and HP1218 belonged toPseudomonassp.,HK1216 belonged toBacillussp.Compared to control without strains,after inoculating wheat seeds with the strains (HN1202,HP1218 and HK1216) respectively,the average root length of wheat seedlings were increased by 12.6%,20.4% and 17.5% respectively;moreover,the average height of wheat seedlings were increased by 11.8%,13.2% and 8.8% separately,and the proportion of five or six roots-germination had been increased significantly.To sum up,the PGPR in this study could be used for the production of functional microbial fertilizers.

plant growth-promoting rhizobacteria; screening; identification; wheat seedling; growth promotion

2016-07-25

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目(152300410092)；河南省高等學校重點科研項目(15B180002，15B180016，15A210020)

常慧萍(1970-)，女，河南原陽人，副教授，博士，主要從事微生物資源開發(fā)與應(yīng)用研究。 E-mail:shengwuchp@126.com

*通訊作者：張 紅(1967-)，女，河南信陽人，教授，博士，主要從事分子生物學與免疫學研究。 E-mail:angela9922@sina.com

時間：2016-11-25 14:24:33

S512.1;S182

A

1004-3268(2016)12-0052-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.015.html