蔣智勇，蔡汝健，李 艷，李春玲

（廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

2014—2016年廣東省PRRSV GP5基因遺傳變異分析

蔣智勇，蔡汝健，李 艷，李春玲

（廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

為監(jiān)測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的遺傳變異情況，采集了2014—2016年間廣東地區(qū)46個(gè)豬場317份疑患PRRS的臨床樣品進(jìn)行檢測，并對(duì)陽性樣品的GP5基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測序，選出21株P(guān)RRSV GP5基因進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明：所分離的PRRSV均屬于美洲株，21株P(guān)RRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為 82.4%～98.7%和 78.6%～98.5%，其中2株與美國NADC30分離株同屬亞群Ⅲ，10株與近幾年廣東省內(nèi)分離的PRRSV毒株QYYZ 和GM2同屬于亞群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，亞群Ⅲ和亞群Ⅳ是近幾年在廣東省內(nèi)流行的新興亞群，研究結(jié)果將為PRRSV疫苗的選擇以及防控方案的制定提供參考。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）；GP5基因；遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的傳染病，給

蔣智勇，蔡汝健，李艷，等.2014—2016年廣東省PRRSV GP5基因遺傳變異分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（12）：90-95.養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重威脅和重大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)抗原性差異，可以將PRRSV分為兩個(gè)血清型，即以VR2332毒株為代表的美洲型和以Lelystad virus（LV）為代表的歐洲型，目前我國流行的病毒株主要為美洲型PRRSV。我國于1996年首次報(bào)道該病毒的存在［1］，此后全國各地均有該病報(bào)道。2006年夏秋季我國南方多個(gè)省份豬群暴發(fā)的“無名高熱”，后來證實(shí)該病是由NSP2缺失30個(gè)氨基酸為特征的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）所引起的［2］。

PRRSV基因組為單股正鏈RNA病毒，全長約為15 kb，包含有9個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），ORFla和ORFl b編碼病毒的RNA聚合酶，ORF2a～ORF7分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。PRRSV的基因易發(fā)生變異，在其結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大是ORF5基因編碼的糖蛋白GP5，同時(shí)也是PRRSV最主要的保護(hù)性抗原蛋白，具有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，常作為標(biāo)記性蛋白用于PRRSV的流行病學(xué)監(jiān)測［3-4］。本研究對(duì)我國廣東地區(qū)2014—2016年上半年采集的臨床病料樣品進(jìn)行了PRRSV的RT-PCR檢測，并對(duì)其主要保護(hù)性抗原GP5基因的變異情況進(jìn)行了分析，為制定PRRSV的防控方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料采集于廣東省內(nèi)46個(gè)豬場（廣州、江門、佛山、清遠(yuǎn)、韶關(guān)、惠州、梅州等地區(qū)）2014－2016年上半年間疑似PRRS發(fā)病豬場病豬（317只）的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器或全血。

病毒DNA/RNA提取試劑盒、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit，E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞和pMD18-T 載體購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照PRRSV CH-la株（GenBank登錄號(hào) AF132118）、JXAl株（GenBank登錄號(hào) EF112445）、GM2（GenBank 登錄號(hào)JN662424）和CHsx1401（登錄號(hào) KP861625）等核苷酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增GP5基因的特異性引物，GP5-F：5′-GTCAACTTTACCAGCTACGT C-3′，GP5-R：5′-CTTGCGGCCTAGCAAGCACA -3′，擴(kuò)增長度為1 071 bp，引物由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。

1.3 PRRSV GP5基因的RT-PCR擴(kuò)增

將采集的病料經(jīng)研磨、離心取上清提取病毒RNA，提取方法按照病毒RNA/DNA快速純化試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取的RNA用40μL ddH2O洗脫。GP5基因的RT-PCR擴(kuò)增按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為50 μL：2×One Step Buffer 25 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1.0 μL，RNase Free dH2O 17.5 μL，模板RNA 4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃30 min，95℃ 2 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后將RT-PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，回收陽性產(chǎn)物并克隆至pMD 18-T載體中，陽性重組菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）測序。

1.4 PRRSV GP5基因的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用生物學(xué)分析軟件DNAStar、ClustalX 2.1PRRSV分離株及GenBank中登錄的16株參考毒株（表1）GP5基因序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行整理和比對(duì)，應(yīng)用軟件MEGA 6.0中鄰接法（Neighbor-joining; bootstrap values of 1 000 replicates）繪制GP5基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品的PRRSV GP5基因RT-PCR擴(kuò)增及序列測定

本研究對(duì)2014—2016年上半年間采集廣東省內(nèi)不同地區(qū)46個(gè)豬場317只疑似 PRRS病死豬的病料樣品，提取病毒RNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，結(jié)果檢出PRRSV陽性樣品182份，陽性率為57.4%，46個(gè)豬場均為陽性豬場。GP5基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后全部送上海英駿生物工程技術(shù)有限公司測序，每個(gè)樣本重復(fù)測序3次。46個(gè)豬場中有26個(gè)豬場擴(kuò)增的PRRSV GP5基因與HP-PRRSV疫苗株GP5基因同源性大于99%，選取其中1株GD-HY6為代表參與后續(xù)分析。其余20個(gè)豬場分離到20株P(guān)RRSV，其GP5基因除1株（GD-HY）缺失了3個(gè)堿基外全長均為603 bp，編碼200個(gè)氨基酸，將獲得的21株P(guān)RRSV序列提交至GenBank，具體登錄號(hào)見表1。

表1 廣東省內(nèi)分離的PRRSV毒株和參考毒株信息

2.2 GP5基因序列遺傳進(jìn)化分析

將21株GP5基因序列與國內(nèi)外已登錄GenBank 的16株P(guān)RRSV參考毒株構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果顯示，本研究測序鑒定的病毒株均屬于PRRSV美洲型，這些毒株可大致分為3個(gè)亞群，分別為以HP-PRRSV JXA1 株為代表的亞群Ⅰ、以美國NADC-30為代表的亞群Ⅲ，以及以近年廣東省內(nèi)分離的以PRRSV重組毒株QYYZ（GenBank登錄號(hào) JQ308798）和GM2（GenBank登錄號(hào) JN662424）為代表的亞群Ⅳ。分離的21株P(guān)RRSV GP5基因與歐洲型LV株的GP5基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為61.8%～64.3%和52.2%～57.7%。本研究采集病料的46個(gè)豬場中有34個(gè)豬場（73.9%）的PRRSV流行株屬于亞群Ⅰ，10個(gè)豬場（21.7%）PRRSV流行株屬于亞群Ⅳ，2個(gè)豬場（4.3%）PRRSV流行株屬于亞群Ⅲ，沒有豬場的PRRSV流行株屬于以美國經(jīng)典PRRSV株VR2332為代表的亞群Ⅱ。

研究獲得的21株GP5基因之間核苷酸序列同源性為82.4%～98.7%，其中GD-BL3、GDMZ、GD-JM、GD-HY6、GD-HD、GD-GY、GDZJ、GD-SS、GD-GZ3與HP-PRRSV中的JX A1株、Hu4株、TJ株高度同源屬于亞群Ⅰ，序列相似度為98.2%～99.2%，與同源亞群Ⅰ的國內(nèi)經(jīng)典株CH1-a序列相似度為94.2%～95.5%；GD-GM、GD-EP與美國分離株NADC-30株屬于亞群Ⅲ，序列相似度分別為94.0%～95.2%；GD-QY2、GD-QY、GD-SG、GD-BL、GD-HY、GD-GZ、GD-HS、GD-KP、GD-HZ、GD-HH與QYYZ和GM2屬于亞群Ⅳ，序列相似度為91.2%～95.0%。

圖1 PRRSV GP5基因遺傳進(jìn)化樹

2.3 GP5基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析

GP5基因測序結(jié)果顯示，除了GD-HY株在第33位發(fā)生了1個(gè)氨基酸缺失，其余毒株的GP5基因全長均為603 bp，編碼200個(gè)氨基酸，21株P(guān)RRSV GP5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為78.6%～98.5%。GP5氨基酸同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，其氨基酸突變位點(diǎn)集中位于aa3～aa39區(qū)域和羧基端aa184～aa200，該區(qū)域位于GP5蛋白的信號(hào)肽（aal～aa31）、誘騙表位（aa27～aa30）、中和位點(diǎn)（aa33～aa47）［5］和非中和位點(diǎn)（aa184～aa200）附近（圖2）。亞群Ⅲ內(nèi)的2株分離株在GP5蛋白中和位點(diǎn)（aa33～aa47）區(qū)域與JXA1相比有3個(gè)氨基酸突變，亞群Ⅳ內(nèi)的10株分離株在此區(qū)域與JX A1相比有4～5個(gè)氨基酸突變，均發(fā)生了較大變化。

圖2 GP5氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果

3 討論

1996年首次證實(shí)PRRSV在我國存在。2006年夏秋季在我國南方部分地區(qū)開始暴發(fā)的HPPRRSV，近些年來在我國大部分地區(qū)流行。2010年以來，由于弱毒活疫苗的廣泛使用，在選擇壓的作用下弱毒活疫苗發(fā)生返強(qiáng)突變，或不同毒株間重組，國內(nèi)多個(gè)研究小組報(bào)道分離了變異較大的PRRSV分離株［6-10］。本研究采集的病料均來自廣東省內(nèi)不同地區(qū)臨床表現(xiàn)為典型PRRS癥狀的豬場，采集病料的46個(gè)豬場均檢測出PRRSV陽性，登錄基因庫的21株P(guān)RRSV分別來自21個(gè)不同的豬場，其余26個(gè)豬場的擴(kuò)增PRRSV GP5基因序列與HP-PRRSV JXA1株同源性均在99%以上，推測可能為疫苗毒所致［11］。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道近年來在我國流行的PRRSV美洲型毒株可分為3～4個(gè)亞群，Xie 等［12］對(duì)廣東省2007—2011年間PRRSV流行株的GP5基因序列分析表明，PRRSV可分為3個(gè)亞群；而Zhang 等［13］對(duì)我國東南地區(qū)2014—2015年間PRRSV流行株GP5基因和NSP2基因的分析結(jié)果顯示，PRRSV可分為4個(gè)亞群，增加了以NADC-30株為代表的亞群Ⅲ。本研究結(jié)果顯示有9株屬于以HP-PRRSV JXA1 株和經(jīng)典株CH-1a為代表的亞群Ⅰ，2株屬于以NADC-30株為代表的亞群Ⅲ和10株屬于以QYYZ和GM2株為代表的亞群Ⅳ，沒有分離到以VR2332株及其疫苗株RespPRRS為代表的亞群Ⅱ。由此可見在廣東省內(nèi)PRRSV流行毒株增加了一個(gè)以NADC-30株為代表的亞群Ⅲ，同時(shí)以QYYZ和GM2株為代表的亞群Ⅳ在廣東省內(nèi)流行有擴(kuò)大的趨勢。

目前，PRRSV流行毒株存在多樣性及變異，而PRRSV野毒株和疫苗毒株在豬場共存并且難以區(qū)分是野毒感染還是疫苗毒感染，同時(shí)也增加了病毒間重組導(dǎo)致新毒株產(chǎn)生的幾率，使得該病在臨床上更加復(fù)雜，也進(jìn)一步加大了防控難度。為了有效防控PRRS，需要進(jìn)一步規(guī)范弱毒疫苗的使用，對(duì)PRRSV流行株進(jìn)行適時(shí)監(jiān)測，同時(shí)對(duì)其致病性及遺傳變異等方面進(jìn)行深入研究，以期為臨床診斷、新型疫苗的研發(fā)提供必要的參考依據(jù)。

［1］ 郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，18（2）：1-4.

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Genetic variation analysis of GP5 gene of PRRSV isolates in Guangdong province during 2014-2016

JIANG Zhi-yong，CAI Ru-jian，LI Yan，LI Chun-ling
（Institute of Veterinary Medicine，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

To investigate the variation in GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），a total of 317 clinical samples were collected from 46 pig farms suspected of PRRSV infection druing 2014-2016.The GP5 genes of PRRSV-positive samples were sequenced and analyzed.Phylogenetic analysis showed that all the isolates belonged to the North America genotype，and these PRRSV GP5 genes had 82.4%-98.7% nucleotide and 78.6%-98.5% deduced amino acid identity to each other.Among them，two isolates formed subgenotype III，which were closely related to the NADC30 strain in the US.10 isolates formed subgenotype IV，were closely related to the recently isolated novel field strains，QYYZ and GM2.This study would provide the basis for selection and improvement of vaccines and comprehensive prevention and control of PRRSV.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；GP5 gene；genetic variation

S852.65+1；Q754

A

1004-874X（2016）12-0090-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.016

2016-08-01

廣東省科技廳農(nóng)村科技領(lǐng)域項(xiàng)目（2015A020209083）；廣東省科技廳科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才服務(wù)領(lǐng)域項(xiàng)目（2014 A070713024）

蔣智勇（1974-），男，在讀博士生，助理研究員，E-mail：jiangzy01@sina.com

李春玲（1965-），女，博士，研究員，E-mail：lclclare@163.com