李培倫，劉偉，王繼隆

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

湯旺河花斑副沙鰍繁殖季節(jié)性腺發(fā)育組織學觀察

李培倫，劉偉，王繼隆

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

運用組織切片技術研究湯旺河花斑副沙鰍Parabotia fasciata繁殖季節(jié)的性腺發(fā)育。結果表明：花斑副沙鰍性成熟系數在6月份最高，其中雄性群體的平均成熟系數為（1.26±0.28）%，雌性群體為（27.6±3.14）%；6～8月，花斑副沙鰍性成熟系數逐漸降低，推斷其繁殖盛期在6月中旬～7月上旬。繁殖季節(jié)湯旺河花斑副沙鰍精巢發(fā)育處于精子形成階段，精小囊相互融合，大量的精細胞向精子轉變，排精后精巢內充滿網狀的結締組織，染色后呈粉紅色，精原細胞游離于囊腔內，精巢結構為典型的小葉型結構?；ò吒鄙出q只有一側卵巢，繁殖季節(jié)卵巢切面顯示，主要由第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（早期）、Ⅴ和Ⅵ5個時相卵母細胞構成，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（早期）和Ⅵ時相卵母細胞主要存在于產后恢復期的卵巢內，第Ⅴ時相卵母細胞存在于成熟卵巢內。成熟卵母細胞卵徑為628.9～893.6μm，放射帶厚度為13.69～20.486μm。依據卵巢切面組織學及性成熟系數月份變化，推測湯旺河花斑副沙鰍為一次性產卵魚類。

湯旺河；花斑副沙鰍；精巢；卵巢

花斑副沙鰍 Parabotia fasciata Dabry屬鰍科（Cobitidae）、沙鰍亞科（Botiinae）、副沙鰍屬（Parabotia），俗稱黃沙鰍、黃鰍、沙鰍、花間刀、雷魚等，為底棲小型經濟魚類，多棲息于江河支岔緩流處，以水生昆蟲和藻類為食[1]，分布于我國北至黑龍江、南至珠江各大水系的干流及其支流，也見于俄羅斯遠東地區(qū)的黑龍江水系[1,2]?；ò吒鄙出q肉質細嫩，營養(yǎng)價值高，深受消費者的喜愛，亦可作為觀賞型魚類[3]，但由于其天然產量較低，價格一直較高。目前，有關花斑副沙鰍的研究主要集中在基礎生物學特征、年齡與生長、繁殖生態(tài)、胚胎發(fā)育、肌肉營養(yǎng)、仔魚攝食生態(tài)等[1-6]，而有關其性腺發(fā)育的研究未見報道。本文通過研究湯旺河花斑副沙鰍繁殖季節(jié)性腺發(fā)育，以期為豐富其繁殖生物學內容、人工繁育規(guī)?；百Y源保護利用等提供基礎。

1 材料與方法

1.1 區(qū)域概況

湯旺河為松花江北岸典型的山溪冷水性第一大支流，是大麻哈魚Oncorhynchus keta、烏蘇里白鮭Coregonus ussuriensis等名貴冷水魚的產卵場和育肥場。本次調查采樣地點為湯旺河下游（46° 40'51.197"～46°42'17.716"N，129°54'7.33"～129°55' 17.69"E），地處亞寒帶大陸性季風氣候區(qū)，春秋兩季時間較短，夏季濕熱多雨，冬季嚴寒而漫長。湯旺河下游沿岸水草風貌，河床底質為砂石、石礫，水質清澈，水深2～4m，適宜魚類生長繁育。

1.2 材料

2013年6～8月，每月走訪漁民2～3次，跟船調查，用小目單層刺網捕撈采樣，并記錄采樣時水溫變化。共采集花斑副沙鰍樣本364尾，其中雄性196尾，雌性168尾，雌雄比例為0.86∶1。新鮮狀態(tài)下測定其體長、體質量，解剖觀察性腺，稱量性腺質量及凈體質量，分別截取性腺前、中、后三部分在Bouin’s液中固定24h后，保存于70%酒精中。

成熟系數（GSI）=（性腺質量/凈體質量）×100%

1.3 組織學觀察

性腺組織用乙醇（80%開始）梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋與切片，切片厚度6μm，蘇木精-伊紅（H.E）染色，中性樹膠封片。用Carl Zeiss顯微鏡觀察，SZSS2000系統(tǒng)拍照。

2 結果與分析

2.1 花斑副沙鰍繁殖季節(jié)的成熟系數與水溫變化

2013年6～8月，湯旺河下游水溫為12～23℃，平均水溫為19.6℃，6月中旬水溫升至17℃，7月中上旬水溫最高，為23℃，其后水溫逐漸下降。經解剖測量，雄性群體體長為11.2～13.9cm，體質量為17.25～30.69g；雌性群體體長為10.9～17.2cm，體質量為16.69～42.91g。湯旺河花斑副沙鰍雄性群體性成熟系數為0.19%～1.686%，其中6月份性成熟系數最高，平均為（1.26±0.28）%；7月次之，平均為（1.06±0.32）%；8月最低，平均值僅為（0.73±0.09）%。雌性群體成熟系數較高，為2.09%～35.7%，其中6月成熟系數最高，平均值為（27.6±3.14）%；7月性成熟系數平均值為（7.16±0.79）%；8月最低，成熟系數平均值為（2.93±0.58）%。整體來講，6～8月份湯旺河花斑副沙鰍性成熟系數隨著月份的推移逐漸降低（表1）。

2.2 花斑副沙鰍精巢發(fā)育特點

表1 湯旺河花斑副沙鰍繁殖季節(jié)的生物學指標Tab.1 Biological indices of barred loach Parabotia fasciata during spawning season

花斑副沙鰍的精巢成對，位于腹腔兩側，繁殖季節(jié)呈乳白色，表面比較光滑，被豐富的血管網絡所覆蓋，單個精巢呈管狀，中間較粗，兩端稍細，兩條輸精管在泄殖孔處合為一。精母細胞發(fā)育分期參考Schulz R W&Miura T對精子發(fā)生過程的分期方法[7]。

繁殖季節(jié)，湯旺河花斑副沙鰍精巢處于精子形成階段，尚未變態(tài)為成熟精子的精細胞聚集在精小囊內，精細胞的核徑很小，著色很深，呈深藍色。隨著生殖季節(jié)的到來，相鄰的精小囊之間相互融合為一個個較大的囊腔，囊腔內的精細胞逐漸進入生精小管的管腔內，變態(tài)為成熟的精子。成熟的精子頭部染色最深，為深藍色，頭部直徑約為4.13～4.58μm（圖版Ⅰ-1），在管腔內呈渦旋狀排列。精子和精細胞的區(qū)別在于：精子在管腔中，而精細胞在囊腔中，待外界環(huán)境條件適合，成熟的精子便通過輸精管排至體外。

繁殖季節(jié)，花斑副沙鰍精巢內精子排至體外之后，精巢組織染成粉紅色，顯得疏松，逐漸縮小，橫切面內部充滿網狀的結締組織（圖版Ⅰ-2）。此外，還能觀察到精原細胞游離于囊腔內，其胞徑19.83～23.66μm，核徑4.48～5.12μm，核居中或偏于一側，著色較深，核膜清晰，胞質著色差（圖版Ⅰ-3）。精巢內尚有少量未排盡的精細胞，此后逐漸被精巢吸收。

2.3 花斑副沙鰍卵巢發(fā)育特點

花斑副沙鰍卵巢不成對，為一個扁平的卵囊。繁殖季節(jié)卵巢呈長而稍扁平圓柱形的囊狀器官，由1根輸卵管通往泄殖孔。卵巢黃綠色，表面覆以被膜，被膜內側有粗的紅褐色主血管，主血管多分支，整個卵巢被網狀的血管網絡包裹。其中卵母細胞的發(fā)育分期參考龔啟祥等[8]對香魚Plecoglossus altivelis卵母細胞的發(fā)育分期方法。

組織切片顯示，繁殖季節(jié)花斑副沙鰍的卵巢由第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（早期）、Ⅴ和Ⅵ5個時相卵母細胞構成。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（早期）時相卵母細胞主要存在于產后恢復期的卵巢內，其中第Ⅰ時相卵母細胞主要位于生殖上皮邊緣，排列比較緊密，呈橢圓形或不規(guī)則多邊形，胞徑23.65～42.73μm，核徑10.41～15.86μm，細胞核較大，約占細胞體積的1/2～2/3，細胞質含量較少且分布密集，嗜堿性強，被染成深藍色（圖版Ⅰ-4）。第Ⅱ時相卵母細胞呈圓形或不規(guī)則的多邊形，原生質體增加，細胞體積顯著增大，胞質顆粒排列相對疏松，嗜堿性變弱，著色淺，細胞核呈圓形，核膜邊緣可以看到若干著色較深的核仁。該時相卵母細胞的胞徑為38.73～204.89μm，核徑為14.96～90.68μm。第Ⅱ時相末期可以看到細胞邊緣出現一層薄薄的濾泡細胞層（圖版Ⅰ-5）。第Ⅲ時相早期卵母細胞最顯著的特點是：在胞質外緣出現幾層小的皮質液泡，隨著卵母細胞的發(fā)育，皮質液泡層數逐漸增多，晚期可延伸至核膜邊緣，該時相早期卵母細胞的胞徑為189.32～285.77μm，核徑為73.25～119.23μm（圖版Ⅰ-6）。第Ⅴ相卵母細胞為成熟的卵子，主要存在于卵巢中。該階段卵巢體積最大，充滿成熟的卵子，輕壓魚腹便有成熟的卵粒流出?；ò吒鄙出q成熟的卵母細胞內充滿粉紅色的卵黃顆粒，位于卵黃質膜外層的放射帶亦清晰可見（圖版Ⅰ-7）。成熟卵母細胞的胞徑為628.9～893.6μm之間，放射帶厚度為13.69～20.486μm（圖版Ⅰ-8）。第Ⅵ時相卵母細胞存在于產卵后的卵巢中，為未排出的卵母細胞。該時相卵母細胞逐漸退化、被吸收，卵膜模糊而斷裂，細胞外的濾泡細胞（顆粒細胞）分生出大量吞噬細胞，進入卵母細胞內吞噬卵黃，卵細胞質和卵黃膠液化，形成許多空泡，直至整個卵母細胞逐漸被周圍細胞完全吸收（圖版Ⅰ-9）。

3 討論

3.1 花斑副沙鰍精巢特點

目前，國內外有關硬骨魚類精巢結構特點的研究很多[9-12]，但是未見有關花斑副沙鰍的報道。一般來講，硬骨魚類的精巢結構分為2種類型[7,13]：小葉型（lobular type），很多魚類都屬此類型，如烏蘇里白鮭Coregonus ussurinsis[11]、黃顙魚Pelteobagrus fluvidraco[14]、大彈涂魚Boleophthalmus pectinirostris[15]、大瀧六線魚Hexagrammos otakii[16]；小管型（tubular type），僅出現于銀漢魚目的某些種類，如體內受精的寬帆鳉Poecilia latipinna。花斑副沙鰍的精巢屬于典型的小葉型結構，精巢中間具有空腔，囊狀的空腔中充滿了精細胞，待到繁殖季節(jié)，相鄰的精小囊融合為大的囊腔，囊腔內的精細胞逐漸進入生精小管的管腔內，變態(tài)為成熟的精子，時機成熟則通過輸精管將精子排至體外。小管型精巢的初級精原細胞只在小管的盲端分布，形成小囊，隨著精子的發(fā)生和精子形成的過程，小囊逐漸向中央腔移動，中央腔與輸精管相通，靠近中央腔的小囊破裂而把成熟的精子釋放到中央腔內[11,16]。

3.2 花斑副沙鰍卵巢與皮質液泡發(fā)生特點

通常，硬骨魚類具有成對的卵巢，而花斑副沙鰍卻只有一個卵巢，與同科的長薄鰍Leptobotia elongata[17]一致，體現了鰍科魚類的物種特異性，也是其在長期進化過程中形成的一種生殖策略。

魚類卵母細胞的發(fā)育過程中出現3種不同類型的營養(yǎng)物質，即皮質液泡、蛋白卵黃顆粒和脂質卵黃滴[18]，在不同魚類中營養(yǎng)物質出現的時間和順序有一定的差異。本研究結果表明：花斑副沙鰍的皮質液泡最早出現在第Ⅲ時相早期的質膜邊緣，隨后數量不斷增多，最后充滿整個核膜外周空間。這一研究結果與葛氏鱸塘鱧Perccottus glenii[19]、犬首鮈Siberian gudgeon[20]等一致。成熟魚卵內充滿卵黃顆粒，皮質液泡消失，說明在花斑副沙鰍受精卵孵化及胚胎發(fā)育過程中主要由卵黃顆粒提供營養(yǎng)物質。

3.3 花斑副沙鰍的繁殖期

魚類的繁殖季節(jié)和持續(xù)的時間是魚類種群長期進化過程中形成的繁殖策略，保證仔魚在餌料規(guī)格和豐度適宜的時候孵出，使后代存活數量趨于最大。研究表明：溫度和晝夜長短是影響魚類繁殖期的關鍵環(huán)境因子[21,22]。遼寧省本溪市太子河中花斑副沙鰍的繁殖高峰期在7月份[1]；湖北孝感市澴河中花斑副沙鰍的繁殖高峰期在7月中旬～8月中旬，其中水溫達到25～32℃為繁殖盛期[4]。依據成熟系數及采捕看，湯旺河花斑副沙鰍的繁殖高峰期為6月中旬～7月上旬，該時期水溫為19～23℃。湯旺河夏季水量充沛、水質清澈、光照充足，適宜花斑副沙鰍產卵繁殖及后代的生長發(fā)育。研究推斷，我國境內花斑副沙鰍的繁殖期集中在6～8月份，而不同地理種群之間存在一定差異，繁殖盛期受水溫、緯度影響較大，隨著緯度的升高，其繁殖盛期逐漸提前。

3.4 花斑副沙鰍的產卵類型

研究表明：魚類產卵類型主要以卵巢外觀特征及產卵前后卵巢中卵母細胞的組成和消長來鑒定[23,24]。魚類卵巢中卵母細胞的發(fā)育可分為三種類型：完全同步型、分批非同步型、不同步型[25]，而產卵類型可分為一次產卵型和分批產卵型[26]。從切片上看，花斑副沙鰍成熟期的卵巢內以第Ⅴ時相卵母細胞為主，卵巢邊緣處有少部分第Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞。產后的卵巢切片中，除部分處于退化吸收的卵母細胞外，大部分為第Ⅱ時相卵母細胞以及少數第Ⅰ時相卵母細胞，并沒有第Ⅳ時相卵母細胞，故推斷花斑副沙鰍卵巢沒有多次產卵的組織學結構。另參照6～8月花斑副沙鰍成熟系數，其卵巢成熟系數逐月降低，且幅度較大，不具備在一個繁殖季節(jié)內再次迅速發(fā)育成熟的條件，這與黃顙魚[14]、大彈涂魚[15]、葛氏鱸塘鱧[19]的研究結果一致。綜上所述，推測花斑副沙鰍為一次產卵型的魚類。

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Histological Observation of Gonadal Development of Barred Loach Parabotia fasciata in Tangwang River During Breeding Season

LI Pei-lun,LIU Wei,WANG Ji-long
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The gonadal developmental of barred loach Parabotia fasciata was studied in Tangwang River during breeding season by a conventional histological method.The results showed that the maximal gonado-somatic index（GSI）was observed in June,with average GSI of（1.26±0.28）%in male population in June,and average GSI of（27.6±3.14）%in female population in June.The peak spawning period of the gonad was speculated to be changed from the middle June to early July,based on the fact that the GSI was declined from June to August.The male populations had testis with developmental spermiogenesis in which the leydig cells were broken into spermatid turning into the sperm.The pink staining testis was full of reticular connective tissue,and the free spermatogonial cells were distributed in intra-testicular cavity,showing typical lobular type testicular structure after spermiation.The barred loach has only singe ovary in one side of abdominal cavity,and in the ovary sections,the phasesⅠ,Ⅱ,Ⅲ（early period）,Ⅴand phaseⅥ,were observed in breeding season and oocyte development in phaseⅠ,Ⅱ,Ⅲ （early period）and phaseⅥoocyte in the ovary after spawning, the phaseⅤoocytes in the matured ovary.The barred loach had mature eggs with diameter ranging from 628.9～893.6 μm,and the zona radiate with thickness of 13.69～20.486 μm.According to the ovary development and gonado-somatic index,it turns out that the barred loach spawns once a year.

Tangwang River;Parabotia fasciata;testis;ovary

圖版Ⅰ 繁殖季節(jié)湯旺河花斑副沙鰍性腺發(fā)育的組織學觀察PlateⅠ Observation of gonadal development in barred loach Parabotia fasciata in Tangwang River in spawning season

S954.4

A

1005-3832（2016）03-0039-05

2016-03-08

農業(yè)部財政專項物種資源保護項目（2014-2018）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303056-5）.

李培倫（1989-），男，研究實習員，從事魚類生理生態(tài)研究.E-mail:lpl19890925@163.com

劉偉（1960-），研究員.E-mail:liuwei_1020@aliyun.com