鄭肖熠，范征吟

1.寧波市鎮(zhèn)海區(qū)招寶山街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，浙江 寧波 315200 2.上海市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200040

大孔吸附樹脂法富集鉤藤散中抗老年癡呆有效成分實驗研究

鄭肖熠1，范征吟2

1.寧波市鎮(zhèn)海區(qū)招寶山街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，浙江 寧波 315200 2.上海市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200040

目的：探討鉤藤散大孔吸附樹脂法不同洗脫物抗老年癡呆（AD）的作用。方法：采用大孔吸附樹脂方法，水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇作為流動相依次對鉤藤浸膏進行洗脫富集。60只大鼠中取10只設(shè)為對照組，剩余大鼠通過Aβ-淀粉樣蛋白（Aβ1-40）注入大鼠腦室，建立AD大鼠模型。將成功造模的大鼠分為水洗脫物組、20%乙醇洗脫物組、50%乙醇洗脫物組、70%乙醇洗脫物組、90%乙醇洗脫物組各10只，將不同洗脫物分別予不同組AD大鼠給藥，給藥20天后，測定其電迷宮法行為學(xué)指標(biāo)，考察各洗脫物對AD大鼠的記憶改善情況。結(jié)果：70%乙醇洗脫物組測試成績與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示鉤藤70%乙醇洗脫物可以提升記憶能力，具有治療老年癡呆的作用；其它洗脫物組大鼠行為測試成績分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示其它洗脫物均不具有改善記憶的能力。結(jié)論：大孔吸附樹脂法可有效分離富集鉤藤的抗老年癡呆成分，70%乙醇洗脫物可有效改善記憶，具有潛在的抗老年癡呆作用。

鉤藤散；老年癡呆癥；大孔吸附樹脂

鉤藤散是我國傳統(tǒng)的中藥復(fù)方，君藥為鉤藤[1]。鉤藤散有降低血壓，可治療暈眩、頭疼、腦梗死等疾病[2]。近年來，研究證實鉤藤散有治療老年癡呆癥的作用。在日本，鉤藤散已被用作老年癡呆常用治療方劑[1]。目前研究認(rèn)為，發(fā)揮治療老年癡呆癥的主要藥物為其君藥鉤藤[3]。本研究通過大孔吸附樹脂方法分離富集不同組分，考察各個組分的抗老年癡呆作用[4]。

1 材料

1.1 中藥 鉤藤散由鉤藤、麥冬、陳皮、半夏、茯苓、防風(fēng)、人參、生姜、甘草、石膏組成。本實驗將主藥鉤藤用95%乙醇進行提取，過濾，蒸干溶劑，得鉤藤浸膏，備用。將浸膏依次用水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇洗脫，洗脫液蒸干，供藥效選用。

1.2 動物 SD大鼠(220～240 g)，共60只，雌雄各半，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。適應(yīng)飼養(yǎng)5天，供試。

1.3 試劑及儀器 兔抗Aβ-淀粉樣蛋白單克隆抗體，乙醇(分析純，國藥集團)，水，AB-8型大孔吸附樹脂(國藥集團)。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，恒溫水浴鍋，分析天平，注射器，醫(yī)用型凈化工作臺，鼠腦立體定位儀。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備 稱取鉤藤粗粉1 000 g，加入2 000 mL的95%乙醇，回流提取2 h，提取液過濾，濾液減壓蒸餾，蒸干溶劑，真空干燥箱內(nèi)干燥12 h，備用。

2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理 AB-8型大孔吸附樹脂加水漂洗，洗去白色渾濁物，加入95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，裝柱，以蒸餾水作為流動相，持續(xù)沖洗，至流出液無醇味為止，用5%氫氧化鈉溶液洗至弱堿性，浸泡5 h，以蒸餾水洗至中性，再用5%鹽酸溶液洗至酸性，浸泡5 h，蒸餾水洗至中性。

2.3 吸附洗脫 樣品鉤藤浸膏用水溶解，濕法上樣。分別用水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇洗脫，每一組份以半個柱體積為一瓶，洗4個柱體積為止。分別收集洗脫液，減壓蒸餾，得各個組分粗提物。

2.4 動物分組 將SD大鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，5組設(shè)為模型組，1組設(shè)為空白對照組。

2.5 Aβ1-40的孵育 Aβ1-40使用生理鹽水稀釋至2 mg/L，37℃下孵育5天，使其成為凝聚態(tài)。

2.6 老年癡呆模型的復(fù)制 將模型組大鼠麻醉后固定于鼠腦立體定位儀，向大鼠左側(cè)海馬區(qū)注入凝聚態(tài)Aβ1-405 μL，留針5 min，使其充分彌散，然后緩慢撤針，封好顱骨，消炎，縫合傷口。空白對照組采用同樣方法，注入等量生理鹽水。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，連續(xù)4天肌注青霉素，防止感染。

2.7 動物給藥 大鼠造模1周后，開始給藥，將模型組大鼠分為水洗脫組，20%乙醇洗脫組，50%乙醇洗脫組，70%乙醇洗脫組，90%乙醇洗脫組。不同模型組大鼠采用粗提物(5 g/kg)給藥，空白對照組每天給等體積的蒸餾水，每天1次，每次20 mL/kg，給藥20天。

2.8 電迷宮法行為學(xué)測試 給藥20天后，進行電迷宮法行為學(xué)實驗。首先，將大鼠放入Ⅰ臂起步區(qū)停留3 min后給于電擊(35v)，按Ⅰ→Ⅲ→Ⅱ→Ⅰ連續(xù)訓(xùn)練。a項：大鼠到達安全區(qū)停留1 min，然后取出放回Ⅰ臂，1.5 min后給予電擊，達到連續(xù)2次直接逃至安全區(qū)后，以逃入的安全區(qū)作為起步區(qū)進行電擊訓(xùn)練。當(dāng)大鼠在Ⅲ臂可以到連續(xù)2次直接逃至安全區(qū)后，進行b項試驗。b項：大鼠在Ⅰ臂起步區(qū)停留1.5 min后給予電擊，逃至安全區(qū)停留1 min，再以此區(qū)作為起步區(qū)予以電擊，連續(xù)循環(huán)電擊訓(xùn)練(每2次電擊之間休息1.5 min)，以大鼠連續(xù)10次(或9/10)正確反應(yīng)(直接逃入安全區(qū))作為空間辨別記憶指標(biāo)，每回連續(xù)學(xué)習(xí)的電擊總次數(shù)一般不超過30次。最后將a項和b項相加作為訓(xùn)練成績，統(tǒng)計學(xué)習(xí)成績。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計工具進行處理。計量資料以(±s)進行表示，各組間比較采用成組設(shè)計比較t檢驗。

4 結(jié)果

對照組測試成績最優(yōu)(24.85±6.23)次，記憶能力最好；在實驗組中，70%乙醇洗脫組(27.23±5.12)次與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示70%洗脫組的鉤藤組分可以有效抑制老年癡呆癥狀，具有一定的改善記憶能力和抗癡呆的作用。

在其它組分中，與對照組比較，測試成績差距較大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示在此洗脫劑中的鉤藤組分不具有或者較差的抗老年癡呆的作用。

表1 鉤藤不同洗脫物對老年癡呆大鼠的記憶影響作用

5 討論

中草藥提取有效組分的常用方法有醇提水沉法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂吸附法、聚酰胺柱層析，制備液相分離法等[5]。其中大孔吸附樹脂吸附方法優(yōu)勢較為明顯，大孔吸附樹脂成本較低，操作簡單，污染較小，溶劑可以回收套用，不吸潮，易制成各種劑型[6]。在本課題研究中，采用AB-8型大孔吸附樹脂對鉤藤的醇提物進行初步分離，進行抗老年癡呆作用的研究[7]。該型樹脂主要成分為聚苯乙烯，比表面積較大，孔徑較大，洗脫容易。對有機溶劑耐受較好，在弱酸和弱堿中穩(wěn)定，可重復(fù)循環(huán)使用。在洗脫液選擇上，用水和乙醇不同比例配比洗脫，從極性較大，洗脫能力弱的水開始洗脫，最后使用極性小，洗脫能力強的90%乙醇進行洗脫[8]。研究發(fā)現(xiàn)，此種洗脫方法的設(shè)定，可以將鉤藤中不同的化學(xué)成分進行較好的分離，達到理想的效果。

Aβ-淀粉樣蛋白是氨基酸殘基短胎，是造成老年癡呆的關(guān)鍵因素[9]。研究證實，側(cè)腦室注射大劑量的Aβ會引起學(xué)習(xí)記憶功能的下降。使用Aβ進行老年癡呆癥動物模型的建立，具有周期短，操作性強等特點，逐步受到國內(nèi)外抗老年癡呆研究人員的青睞[10]。其主要注射在動物腦部的海馬，腦室兩處。其中，本文選擇將抗體直接注入大鼠腦室中，經(jīng)腦室彌漫至整個腦部，更接近于實際作用過程，是抗老年癡呆藥物臨床前評價的重要手段[11]。

鉤藤散是由多種中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱平肝，熄風(fēng)止痙等作用，臨床上主要用頭暈、中風(fēng)、癲癇等疾病。近年來，大量研究證實鉤藤散具有抗老年癡呆的作用。其可以提高腦脂數(shù)和抗氧化酶能力，有效清除脂質(zhì)過氧化物和其代謝產(chǎn)物，抑制單胺氧化酶，維持一氧化氮正常水平，能夠改善腦血流量，以抗高血壓，消除自由基和抗興奮性中毒等途徑發(fā)揮抗老年癡呆作用[12～13]。目前研究認(rèn)為，在鉤藤散復(fù)方制劑中，發(fā)揮抗老年癡呆作用的主要物質(zhì)是其君藥鉤藤。因此，本研究通過大孔吸附樹脂方法對鉤藤浸膏進行分離，富集。實驗表明，在70%的乙醇洗脫的提取物實驗組與正常大鼠的對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，對大鼠記憶能力改善效果較好；在其它實驗組中，與對照組比較，大鼠的記憶能力較差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示其它梯度的乙醇提取液中沒有抗老年癡呆的有效成分。這提示大孔吸附樹脂可以富集抗老年癡呆的有效成分。

本課題表明鉤藤的70%乙醇提取物具有一定改善記憶能力和抗老年癡呆作用，但其具體的化學(xué)成分以及抗老年癡呆的分子機制仍需進一步探討。

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

Experiment Study on Enrichment of Anti-AD Effective Component in Gouteng San with Macroporous Resin

ZHENG Xiaoyi，F(xiàn)AN Zhengyin

Objective：To discuss the effect of different components in Gouteng san on resisting Alzheimer's disease(AD). Methods：By adopting the method of macroporous resin，water，20%ethanol，50%ethanol，70%ethanol，90%ethanol as mobile phase，elution and enrichment of Gouteng san were carried out in sequence.β-amyloid protein(Aβ1-40)was injected into ventricles of rats，and the AD rat model was established.Rats in different groups were given extractions of each component.Another ten rats were set as the blank group without any treatment.After giving medicine for 20 days，determined their behavior indexes in the electric maze and inspected the effect of each component on improving AD rats’memory.Results：Experiment suggested that in the 70%of ethanol extraction group，compared test performance of the blank group，there were no significant difference(P＞0.05)，which showed that Gouteng san extraction of 70%of ethanol can improve memory ability effectively and have an effect in treating AD.Rats’ test performances in other groups were lower than those of normal rats(P＜0.05)，indicating that ethanol extractions of other gradients can not improve memory. Conclusion：Macroporous resin can effectively separate the anti-AD component in enriched Gouteng san.70%of ethanol extraction can improve memory effectively and have the potential for resisting AD.

Gouteng san；Alzheimer's disease；Macroporous resin

R284

A

0256-7415（2016）12-0214-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.090

2016-06-25

鄭肖熠（1982-），女，主管中藥師，主要從事中醫(yī)中藥研究工作。