李?yuàn)u東華，徐丙超，陳莉，季興，董萬利

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006 2.中國人民解放軍第303醫(yī)院，廣西 南寧 530021 3.連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000 4.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022

運(yùn)動(dòng)療法對缺血腦組織大鼠BDNF的影響

李?yuàn)?，2，鄒東華2，徐丙超3，陳莉4，季興2，董萬利1

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006 2.中國人民解放軍第303醫(yī)院，廣西 南寧 530021 3.連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000 4.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022

目的：探討運(yùn)動(dòng)療法對大鼠缺血腦組織的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的影響。方法：采取Zea-Longa線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型（MCAO），成功造模48只大鼠，采取隨機(jī)數(shù)字表法將入組的大鼠分為運(yùn)動(dòng)組和對照組，各24只。運(yùn)動(dòng)組給予水迷宮訓(xùn)練和滾籠訓(xùn)練，對照組限制行動(dòng)。2組大鼠分別進(jìn)行再分組，分為第1天、第7天、第14天三個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只，分別于造模后第1天、第7天、第14天每組取3只測量腦組織梗死面積百分率，取5只測量BDNF的陽性表達(dá)。結(jié)果：在第7天和第14天，運(yùn)動(dòng)組腦梗死面積百分率均低于對照組，BDNF的表達(dá)明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。運(yùn)動(dòng)組中，第14天的腦梗死面積百分率明顯低于第7天，第14天BDNF的表達(dá)高于第7天，第7天BDNF的表達(dá)高于第1天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組中，第7天BDNF的表達(dá)高于第1天，第14天BDNF的表達(dá)高于第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)療法可以通過上調(diào)BDNF，起到控制腦缺血面積以及神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，對腦組織有一定保護(hù)作用。

運(yùn)動(dòng)療法；腦梗死；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）；大鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

腦卒中(stroke)是由于腦血管梗死所引起的腦構(gòu)造缺血缺氧，從而導(dǎo)致部分腦神經(jīng)功能異常的一類疾病，臨床主要表現(xiàn)為惡心吐逆、頭痛、頭暈、失語、肢體偏癱、意識障礙等癥狀。缺血性腦損傷的病理機(jī)制是由細(xì)胞內(nèi)外多因素、多物質(zhì)介導(dǎo)的炎性細(xì)胞參與的神經(jīng)元的壞死或凋亡。其中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)在腦卒中的神經(jīng)元修復(fù)中有重要作用，其作用機(jī)制是與特異性卵白受體激酶B(TrkB)結(jié)合發(fā)揮高親和營養(yǎng)作用。BDNF主要分布于大腦皮質(zhì)、基底節(jié)、海馬、紋狀體等膽堿能神經(jīng)元中[1]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可以保護(hù)缺血后神經(jīng)元，改善神經(jīng)元病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)再生及分化成熟[2]。Sarrelainen研究表明缺乏BDNF基因的大鼠較對照組腦梗死面積大，而提高內(nèi)源性BDNF水平可減輕腦缺血后神經(jīng)元的損傷程度，提示BDNF對神經(jīng)元有一定保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究的是運(yùn)動(dòng)療法后大鼠腦組織BDNF的表達(dá)，探討其在大鼠缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 優(yōu)選雄性Wistar大鼠60只，鼠齡12～16周，體重280±20 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號：scxk桂2009 0002)，室溫控制在25℃～28℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給普通飼料和自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的飼養(yǎng)、訓(xùn)練、手術(shù)及取材均遵循動(dòng)物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 模型參照Zea-Longa線栓法[4]，從而復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO)。大鼠用10%的水合氯醛麻醉，暴露出左邊頸總動(dòng)脈和分叉部，分離動(dòng)脈分叉處的頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，并分別穿線備用。將漁線前端加熱成直徑為235 mm，長度約為5 cm的圓形，用肝素浸泡后從剪口處插入，使?jié)O線經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向頭端深入至有阻力時(shí)，即阻斷大腦中動(dòng)脈入口處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及剪口處，干凈縫合傷口。術(shù)中大鼠呈現(xiàn)呼吸困難，屢次出現(xiàn)棄之。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 MCAO造模成功，動(dòng)物清醒后，進(jìn)行行為學(xué)5分制評分[5]，1～3分入組，入組成功48只。將造模成功的48只大鼠，采取隨機(jī)數(shù)字表法分為運(yùn)動(dòng)組(24只)和對照組(24只)。運(yùn)動(dòng)組采用水迷宮和滾籠練習(xí)，對照組限制行動(dòng)。2組大鼠分別進(jìn)行再分組，分為第1天、第7天、第14天三個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。分別于造模后第1天、第7天、第14天每組取3只測量腦組織梗死面積百分率，取5只測量BDNF的陽性表達(dá)率。

1.4 運(yùn)動(dòng)治療 ①水迷宮練習(xí)：水迷宮為直徑150 cm、高70 cm的圓形水槽，內(nèi)盛無毒乳白色溶液，液面距池壁上緣24 cm。將一個(gè)高44.5 cm、直徑8 cm的白色站臺隨機(jī)放入池中某一象限內(nèi)的固定位置，站臺平面沒于液面下2～3 cm。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠從另外3個(gè)象限隨機(jī)放入池中，如果3 min后仍找不到站臺，則人為將其放在站臺上持續(xù)15 s。每天練習(xí)3次，每次間歇10 min。②滾籠練習(xí)：滾籠長100 cm，直徑60 cm，內(nèi)分4格，同時(shí)可以練習(xí)4只大鼠，按5 r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，每天練習(xí)10 min。

1.5 腦梗死面積百分率的測定 將每個(gè)亞組3只大鼠分別于第1天、第7天、第14天斷頭取大腦，并放入-20℃冰箱速凍30 min，將取出后的大腦切除嗅球以及小腦部分，將大腦平均切成6片，每片厚2 mm，置于0.4%的2，4，5-三苯四氮唑(TTC)溶液中，37℃恒溫15～20 min。取出腦片后，在相同情況下拍照，用圖像分析軟件分析計(jì)算梗死面積的百分率。

1.6 免疫組化檢測腦組織中的BDNF 分別于造模后第1天、第7天、第14天每組取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，斷頭取腦，于梗死灶處冠狀切去腦組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。采取通例SP法(鏈霉素抗生蛋白-過氧化物酶鏈接法)組織化學(xué)染色。①脫蠟：水化組織切片；②內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑10 min；③滴加BDNF多克隆抗體(1：200)，4℃過夜，0.01 mol/LPBS沖洗2min，3次；④滴加聚合物輔助劑，37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗2 min，3次；⑤滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/大鼠IgG(1∶500)，37℃孵育20～30 min，0.01 mol/LPBS沖洗2 min，3次；⑥D(zhuǎn)BA染色，光鏡下觀察監(jiān)控染色反應(yīng)5～15 min；⑦予以蒸餾水重復(fù)沖洗，復(fù)染，脫水，封片。光鏡下細(xì)胞質(zhì)或者核膜上有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，于陽性細(xì)胞分布區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的高倍鏡視野(400×)，計(jì)算BDNF陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果采取SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，梗死面積采取Manny-whitney法檢測，BDNF陽性細(xì)胞的比較采取單因素方差分析，計(jì)量資料均以(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死面積百分率結(jié)果比較 在第7天和第14天，運(yùn)動(dòng)組腦梗死面積百分率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。運(yùn)動(dòng)組中，第14天的腦梗死面積百分率明顯低于第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腦梗死面積百分率結(jié)果比較 %

2.2 各組大鼠免疫組化結(jié)果比較 在第7天和第14天，運(yùn)動(dòng)組BDNF的表達(dá)明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組中，第7天BDNF的表達(dá)高于第1天，第14天BDNF的表達(dá)高于第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。運(yùn)動(dòng)組中，第7天BDNF的表達(dá)高于第1天，第14天BDNF的表達(dá)高于第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠BDNF陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較 個(gè)/cm2

3 討論

康復(fù)醫(yī)學(xué)需要解決的問題主要是運(yùn)動(dòng)功能障礙，目前運(yùn)動(dòng)療法已成為康復(fù)治療的主要治療方法。康復(fù)訓(xùn)練增進(jìn)受損神經(jīng)功能恢復(fù)的研究日趨受到重視。運(yùn)動(dòng)療法是指在專業(yè)醫(yī)生的指導(dǎo)下通過特定的運(yùn)動(dòng)方式(主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)動(dòng)等)，使用器械、徒手或患者自身力量，使全身或局部運(yùn)動(dòng)功能、感覺功能恢復(fù)的訓(xùn)練方法。運(yùn)動(dòng)療法主要分為良肢體位擺放、被動(dòng)運(yùn)動(dòng)、移動(dòng)訓(xùn)練三類。良肢體位擺放和被動(dòng)運(yùn)動(dòng)在發(fā)病當(dāng)時(shí)即可進(jìn)行，移動(dòng)訓(xùn)練應(yīng)在患者神志清楚，病情穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行[6]。Ding Y等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注的大鼠動(dòng)物模型通過進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，可以明顯減少紋狀體神經(jīng)元缺失和梗死范圍，同時(shí)，大鼠大腦皮質(zhì)以及紋狀體的BDNF表達(dá)也有所增加。同時(shí)也有研究表明神經(jīng)營養(yǎng)因子在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后表達(dá)增強(qiáng)[8]。本研究也證實(shí)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)大腦恢復(fù)、減少腦梗死面積，促進(jìn)BDNF的表達(dá)，修復(fù)損傷腦組織，與上述研究一致。

BDNF在腦卒中可能的保護(hù)機(jī)制：①可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度；②具有抗氧自由基的作用，有研究表明BDNF可調(diào)節(jié)氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化酶(GSR-Px)在神經(jīng)元細(xì)胞中的含量，達(dá)到抗氧自由基，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用[9]；③有抗細(xì)胞調(diào)亡作用。Han等研究表明，缺血缺氧導(dǎo)致新生鼠腦組織損傷，激活 caspase-3從而引發(fā)神經(jīng)元凋亡，而BDNF可以阻斷caspase-3的激活，抑制細(xì)胞凋亡[10]；④有神經(jīng)元保護(hù)作用。BDNF在中樞神經(jīng)元中可能通過激活特定的信號傳遞途徑或者通過逆轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的活性，來保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[11]。本研究也表明通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，可以使BDNF表達(dá)增加，對腦組織有一定保護(hù)作用。BDNF為蛋白類物質(zhì)，無法通過消化道給藥，也無法通過血腦屏障，因此將BDNF直接應(yīng)用到臨床有一定困難性。運(yùn)動(dòng)療法可以通過上調(diào)BDNF，起到控制腦缺血面積以及神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，對腦組織有一定保護(hù)作用。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Exercise Therapy on BDNF of Rats with Cerebral Ischemia

LI Jing，ZOU Donghua，XU Bingchao，CHEN Li，JI Xing，DONG Wanli

Objective：To discuss the effect of exercise therapy on brain-derived neurotrophic factor(BDNF)of rats with cerebral is chemia.Methods：Adopted suture-occluded method to duplicate middle cerebral artery occlusion(MCAO)model and successfully established 48 rat models.Divided rats into the exercise group and the control group，24 rats in each group by applying the method of random number form.Rats in the exercise group were given water-maze training and rolling cage training while actions of rats in the control group were restricted.Divided rats in these two groups again into the first-day subgroup，the seventh-day subgroup and the fourteenth-day subgroup，three subgroups in total with 8 rats in each.On the first day，the seventh day and the fourteenth day after the establishment of rat model，selected three rats in each subgroup and determined their percentages of infarcted cerebral constitution area；selected three rats and determined their expression of BDNF.Results：On the seventh day and the fourteenth day，percentage of infarcted cerebral constitution area in the exercise group was lower than that in the control group，while its expression of BDNF was obviously higher than that of the control group(P＜0.05).In the exercise group，percentage of infarcted cerebral constitution area on the fourteenth day was significantly lower than that on the seventh day(P＜0.05).The expression of BDNF on the fourteenth day was higher than that on the seventh day，and the expression of BDNF on the seventh day was higher than that on the first day，the differences being significant(P＜0.05).In the control group，expression of BDNF on the seventh day was higher than that on the first day，and expression of BDNF on the fourteenth day was higher than that on the seventh day，showing significance of the differences(P＜0.05).Conclusion：Exercise therapy have an effect on controlling the infarcted cerebral constitution area as well as protecting and recovering nerves，which protects cerebral constitution.

Exercise therapy；Cerebral infarction；Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)；Rats；Animal experiment

R285.5

A

0256-7415（2016）12-0211-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.089

2016-07-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81560205）；廣西衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃科研項(xiàng)目（Z2012470，Z2012473）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFAA276028）

李?yuàn)?981-），女，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘、腦血管病。

董萬利，E-mail：dwlsz8@163.com。