馮小映，林靜吟，李麗月

廣州市正骨醫(yī)院，廣東 廣州 510045

續(xù)骨油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馮小映，林靜吟，李麗月

廣州市正骨醫(yī)院，廣東 廣州 510045

目的：為建立續(xù)骨油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用薄層色譜法對(duì)續(xù)骨油中大黃、降香和鬧羊花作定性鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)雙酯型生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿）總堿含量及士的寧含量作限量檢查，雙酯型生物堿的檢測(cè)流動(dòng)相A是乙腈-四氫呋喃（5∶3），流動(dòng)相B是0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL），檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；士的寧的檢測(cè)流動(dòng)相A是乙腈，B是0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)PH值2.8）；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果：大黃、降香、鬧羊花的鑒別方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，雙酯型生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿）總堿平均含量為0.011 0 μg/mL，士的寧的平均含量為0.620 6 μg/mL，均未超過(guò)規(guī)定要求。結(jié)論：所建立的檢驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性較好，可為續(xù)骨油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

續(xù)骨油；大黃；降香；鬧羊花；雙酯型生物堿；士的寧；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

續(xù)骨油是本院使用多年的制劑，在臨床中，療效確切，主要作用為活血化瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨，常用于急慢性軟組織挫傷、骨折、瘀血腫痛等病癥。續(xù)骨油主要是由續(xù)斷、降香、川烏、草烏、馬錢(qián)子、大黃、鬧羊花等味中藥組成。處方中含有多味有毒中藥材，本試驗(yàn)利用高效液相法建立了川烏、草烏中的有毒成份烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿及馬錢(qián)子中的士的寧的限量檢查方法；同時(shí)建立了處方中大黃、降香、鬧羊花的薄層色譜鑒別方法，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供科學(xué)可靠的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo高效液相色譜儀及色譜工作站(美國(guó))，Dionex Ultimate檢測(cè)器；Sartorius BSA224S型電子分析天平(德國(guó))；FA2004型電子天平(上海上天)；超純水處理系統(tǒng)(湖南科爾頓)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；KQ-100B型超聲波清洗器(東莞科橋)；薄層層析硅膠G板(德國(guó)默克)；薄層層析硅膠H板(青島海洋化工)。

1.2 材料 對(duì)照藥材降香(批號(hào)：121272-201103)、鬧羊花(批號(hào)：121174-200802)、大黃(批號(hào)：120984-201202)及對(duì)照品烏頭堿(批號(hào)：110720-201111)、新烏頭堿(批號(hào)：110799-201106)、次烏頭堿(批號(hào)：110798-201307)及士的寧(批號(hào)：110705-201307)均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；試劑除乙腈為色譜純外，其余均為分析純；續(xù)骨油樣品(批號(hào)：20150601、20150901、20151101)及其陰性對(duì)照品均由廣州市正骨醫(yī)院制劑室制備。

2 鑒別

2.1 大黃[1]取續(xù)骨油樣品30 mL，加甲醇30 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，分取濾液，蒸干甲醇，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，滴加鹽酸1 mL，加熱回流提取30 min，立即冷卻，用無(wú)水乙醚萃取2次，每次20 mL，合并無(wú)水乙醚萃取液，揮干無(wú)水乙醚，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。分別取缺大黃的陰性樣品30 mL及大黃對(duì)照藥材0.1g，按供試品溶液的制備方法制成缺大黃的陰性對(duì)照溶液和大黃對(duì)照藥材溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液色譜未見(jiàn)相同斑點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 大黃TLC圖譜

2.2 降香[1]取續(xù)骨油樣品60 mL，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，分取上層溶液，蒸干甲醇，殘留物加甲醇2 mL使溶解，靜置，取上層液1 mL作為供試品溶液。取不含降香的陰性樣品，同法制成缺降香的陰性對(duì)照溶液。再取降香對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇5 mL，超聲波提取30 min，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述的降香供試品溶液及缺降香的陰性對(duì)照溶液各5 μL，降香對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑是甲苯-二氯甲烷-丙酮(5：5：0.5)，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與降香對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液色譜未見(jiàn)相同斑點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。

圖2 降香TLC圖譜

2.3 鬧羊花[2]先取缺鬧羊花的陰性樣品，照上述2.2項(xiàng)下降香的供試品溶液的制備方法制成缺鬧羊花的陰性對(duì)照溶液；再取鬧羊花對(duì)照藥材1 g，加水飽和正丁醇50 mL，超聲波提取30 min，靜置，取上層液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為鬧羊花對(duì)照藥材溶液。吸取2.2項(xiàng)下的續(xù)骨油供試品溶液及上述的缺鬧羊花的陰性對(duì)照溶液各5 μL、鬧羊花對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑是三氯甲烷-甲醇(10∶1)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液色譜未見(jiàn)相同斑點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。

3 烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的限量檢查[1，3]

3.1 色譜條件 色譜柱：Dionex AcclaimTM120，C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A：乙腈-四氫呋喃(5∶3)；流動(dòng)相B：0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)；波長(zhǎng)：235 nm；理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；進(jìn)樣量：10 μL。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

圖3 鬧羊花TLC圖譜

表1 梯度洗脫比例

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，混合，再加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解，制成每1 mL分別含烏頭堿0.136 mg、新烏頭堿0.136 mg及次烏頭堿0.42 mg的混合溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取續(xù)骨油樣品150 mL，用2%鹽酸溶液100 mL振搖，靜置30 min，分取下層酸水液，用無(wú)水乙醚洗滌提取3次，每次50 mL，上層無(wú)水乙醚液棄去，下層酸水液加入濃氨試液，調(diào)節(jié)pH值至10～11后，再用無(wú)水乙醚萃取3次，每次50 mL，最后合并所有的無(wú)水乙醚提取液，再在45℃以下減壓回收無(wú)水乙醚至干，殘?jiān)卯惐?三氯甲烷(1∶1)混合溶液2 mL使溶解，即得。

3.4 專(zhuān)屬性考察 按處方量稱(chēng)取缺草烏、川烏的其它藥材，照續(xù)骨油生產(chǎn)工藝制成缺草烏、川烏的陰性樣品，根據(jù)3.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成缺草烏、川烏的陰性對(duì)照溶液；照上述相應(yīng)的色譜條件測(cè)定，在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的色譜圖中，未見(jiàn)烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的色譜峰，結(jié)果顯示方法專(zhuān)屬性良好。

3.5 精密度試驗(yàn) 平行量取6個(gè)續(xù)骨油樣品(批號(hào)：20150901)，精密量取，按上述的高效液相色譜法檢測(cè)，測(cè)定烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿的總含量，結(jié)果RSDO 2.27%，表明儀器的精密度良好。

3.6 檢測(cè)限試驗(yàn) 見(jiàn)表2。取3.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按上述3.1項(xiàng)下的色譜條件，吸取0.25 μL注入高效液相色譜儀，根據(jù)所得峰面積折成3倍信噪比，計(jì)算。

表2 雙酯型生物堿檢測(cè)限結(jié)果

3.7 耐用性試驗(yàn) 取續(xù)骨油(批號(hào)：20150601)供試液，另取島津C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，照上述高效液相色譜法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果供試品色譜中峰形及分離度均良好。

3.8 樣品中雙酯型生物堿的限量檢查 見(jiàn)表3。精密量取續(xù)骨油樣品(批號(hào)：20150601、20150901、20151101)，按3.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按上述的雙酯型生物堿的限量檢測(cè)方法檢測(cè)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總堿含量。

表3 續(xù)骨油中雙酯型生物堿量度檢查結(jié)果

4 士的寧的限量檢查[1，4]

4.1 色譜條件 色譜柱：Dionex AcclaimTM120，C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：A是乙腈，B是0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值2.8)；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；理論板數(shù)按士的寧峰計(jì)算應(yīng)不低于5000；進(jìn)樣量：士的寧對(duì)照品溶液1 μL，續(xù)骨油供試品溶液10 μL。

4.2 對(duì)照品溶液的制備 取士的寧對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加三氯甲烷適量使溶解，然后加入甲醇稀釋到刻度，制成每1mL含士的寧0.15 mg的對(duì)照品溶液，即得。

4.3 供試品溶液的制備 取續(xù)骨油樣品60 mL，置250 mL具塞錐形瓶中，加入0.5%鹽酸溶液50 mL，回流提取2 h，轉(zhuǎn)至分流漏斗中，錐形瓶用0.5%鹽酸30 mL反復(fù)洗滌，合并，靜置，分取下層液，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH值9～10，再用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并所有的三氯甲烷萃取液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，即得。

4.4 專(zhuān)屬性考察 按處方量稱(chēng)取缺馬錢(qián)子的其它藥材，照續(xù)骨油生產(chǎn)工藝制成不含馬錢(qián)子的陰性對(duì)照樣品，按4.3供試品溶液的制備方法制成缺馬錢(qián)子的陰性對(duì)照溶液，照4.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的色譜圖中，未見(jiàn)士的寧的色譜峰，說(shuō)明方法專(zhuān)屬可行。

4.5 精密度試驗(yàn) 平行精密量取6個(gè)續(xù)骨油樣品(批號(hào)：20150901)各約150 mL，按上述的士的寧限度檢查方法檢測(cè)，測(cè)定樣品中士的寧含量，結(jié)果RSD為1.87%，表明儀器精密度良好。

4.6 檢測(cè)限試驗(yàn) 見(jiàn)表4。精密稱(chēng)取士的寧對(duì)照品，稀釋成每1 mL分別含0.010 1 mg的溶液，按檢查方法的色譜條件，吸取1 μL注入液相色譜儀，測(cè)得其信噪比為2.9，確定其檢出限為0.010 1 μg。

表4 士的寧檢測(cè)限結(jié)果

4.7 耐用性試驗(yàn) 取續(xù)骨油(批號(hào)：20150601)供試液，另取島津C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱按上述的高效液相色譜法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果供試品色譜中峰形及分離度均良好。

4.8 樣品中士的寧的限量檢查 見(jiàn)表5。精密量取續(xù)骨油樣品(批號(hào)：20150601、20150901、20151101)，按4.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按上述的士的寧的限量檢測(cè)方法檢測(cè)士的寧的含量。

表5 續(xù)骨油中士的寧限量檢查結(jié)果

5 討論

本實(shí)驗(yàn)采用薄層層析色譜法鑒別了續(xù)骨油中大黃、降香、鬧羊花，結(jié)果顯示，該三個(gè)藥材所得的薄層層析色譜斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，續(xù)骨油供試品色譜在與各對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)良好，且專(zhuān)屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可行。

續(xù)骨油處方中川烏、草烏為國(guó)家規(guī)定的28味有毒中藥材，為了保證患者臨床用藥的安全有效性，避免和減少不良反應(yīng)的發(fā)生，本研究采用高效液相色譜法對(duì)3批次續(xù)骨油作了雙酯型生物堿(烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿)的限量檢查，結(jié)果顯示其平均含量為0.011 0 μg/mL。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》制川烏項(xiàng)下規(guī)定，雙酯型生物堿含量限度為含烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿總量不得超過(guò)0.040%，其“用法用量”項(xiàng)下規(guī)定制川烏的每天最大服用量為3 g，折算后烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿總量每天服用量限度約為1.2 mg，即為每天最大安全服用量。續(xù)骨油為外用制劑，說(shuō)明書(shū)規(guī)定每天使用3～5次，按每次常用量為10 mL，即每日最大使用量應(yīng)為50 mL。綜合藥材質(zhì)量等因素，因此設(shè)定樣品每毫升含烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿總量不得超過(guò)24 μg。結(jié)果顯示符合雙酯型生物堿含量限度標(biāo)準(zhǔn)。

同時(shí)，續(xù)骨油處方中馬錢(qián)子也是具有較強(qiáng)毒性的中藥材，本研究也利用高效液相色譜法對(duì)3批次的續(xù)骨油作了士的寧的限量檢查，結(jié)果顯示士的寧的平均含量為0.620 6 μg/mL。依據(jù)《中國(guó)藥典》馬錢(qián)子粉項(xiàng)下規(guī)定，士的寧含量限度不得過(guò)0.82%，其“用法用量”項(xiàng)下規(guī)定馬錢(qián)子的服用量為0.6 g，折算后士的寧每天服用量約為4.92 mg，即每天最大安全服用量。本制劑為外用制劑，每天使用3～5次，按每次常用量為10 mL，即每天最大使用量為50 mL。按理論計(jì)算樣品每1 mL含士的寧應(yīng)不得過(guò)264 μg；為保證臨床用藥安全，降低患者的不良反應(yīng)，按《中國(guó)藥典》馬錢(qián)子粉項(xiàng)下士的寧含量限度計(jì)算，并結(jié)合實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果，把實(shí)際樣品每1 mL含士的寧設(shè)置為應(yīng)不得超過(guò)98.4 μg。結(jié)果顯示符合士的寧含量限度標(biāo)準(zhǔn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].1部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22，36，47，210，213，附錄34，附錄36.

[2]朱秀奎，袁春芳，董文慧，等.鎮(zhèn)痛口服液中鬧羊花、姜黃的薄層色譜鑒別[J].中成藥，1994(11)：54.

[3]周敏杰，陳奕伸，林靜吟，等.萬(wàn)應(yīng)理傷膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥材，2015，38(2)：395-397.

[4]李嘉華，陳奕伸，馮小映，等.雙香貼膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥材，2014，37(11)：2096-2098.

（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Research on Quality Standard of Xugu Oil

FENG Xiaoying，LIN Jingyin，LI Liyue

Objective：To provide scientific evidence for establishing research method on quality standard of Xugu oil. Methods：Rhubarb，lignum acronychiae，flos Rhododendri Mollis in Xugu oil were identified by thin layer chromatography (TLC).Limit test for total alkaloid content in diester diterpenoid alkaloids(DDAs)(aconitine，hypaconitine，Mesaconitine)and content of Strychnine by high performance liquid chromatography(HPLC).Detection mobile phase A of DDAs was acetonitriletetrahydrofuran(5∶3)，mobile phase B was 0.1 mol/L ammonium acetic solution(add glacial acetic acid 0.5 mL per 1 000 mL)，detection wavelength was 238nm.Detection mobile phase A of Strychnine was acetonitrile，mobile phase B was equivalent mixed solution of 0.01 mol/L sodium heptanesulfonate and 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate(adjust the pH value to 2.8 With 10%phosphoric acid)，detection wavelength was 260 nm.Results：Differentiation method of rhubarb，lignum acronychiae and flos Rhododendri Mollis were specific，average total alkaloid content of DDAs were 0.011 0 μg/mL，average content of strychnine was 0.620 6 μg/mL，did not exceed the specified requirements.Conclusion：Method for examination in the research is a simple，specific method with good reproducibility.It can provide scientific evidence for establishing quality standard of Xugu Oil.

Xugu oil；Rhubarb；Lignum acronychiae；Flos Rhododendri Mollis；Diester diterpenoid alkaloids(DDAs)；Strychnine；Quality standard

R284

A

0256-7415（2016）12-0207-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.088

2016-07-05

馮小映（1975-），女，副主任中藥師，研究方向：中藥制劑。