張劍勇，王輝，謝靜靜，肖敏，李丹

1.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳518033；2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518100

◆實(shí)驗(yàn)研究◆

痛風(fēng)泰顆粒對(duì)急性痛風(fēng)大鼠IL-1、IL-6及TNF-α含量的影響

張劍勇1，王輝2，謝靜靜1，肖敏1，李丹1

1.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳518033；2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518100

目的：觀察痛風(fēng)泰顆粒對(duì)急性痛風(fēng)大鼠炎癥因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的影響，探討痛風(fēng)泰顆粒治療痛風(fēng)的可能作用機(jī)理。方法：將36只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、痛風(fēng)泰顆粒組、戴芬組，除空白組外，其他三組建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理模型。造模成功后，分別藥物干預(yù)7天，觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠造模前后關(guān)節(jié)膚色、膚溫、腫脹等情況，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)大鼠右內(nèi)踝關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6的含量和血清中TNF-α含量。結(jié)果：與空白組比較，模型組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著升高（P＜0.05），提示急性痛風(fēng)模型造模成功。與模型組比較，痛風(fēng)泰顆粒組和戴芬組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。痛風(fēng)泰顆粒組與戴芬組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：痛風(fēng)泰顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)抑制炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放來(lái)治療痛風(fēng)。

痛風(fēng)泰顆粒；急性痛風(fēng)；白細(xì)胞介素-1（IL-1）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙，血尿酸水平增高，導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織所引起的特征性關(guān)節(jié)炎癥。西藥雖然能夠較快控制臨床癥狀，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，但長(zhǎng)期服藥的副作用致使患者依從性下降，不利于病情的控制。本研究旨在通過(guò)觀察痛風(fēng)泰顆粒對(duì)急性痛風(fēng)大鼠模型炎癥因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量的影響，探討該方治療急性痛風(fēng)的可能作用機(jī)理，為其臨床運(yùn)用提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠36只，雄性，體重160～200 mg，購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002)。36只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、痛風(fēng)泰顆粒組、戴芬組，每組9只。

1.2 藥物制備 痛風(fēng)泰顆粒(土茯苓45 g，川萆薢30 g，秦艽15 g，山慈菇、赤芍、川牛膝各10 g，山茱萸6 g)，由深圳市中醫(yī)院提供，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為1306302。各藥混勻后用開(kāi)水?dāng)嚢?，制? g/mL的混懸液。雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊(商品名：戴芬，75 mg/粒)由Temmler Werke GmbH生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為109361，由深圳市中醫(yī)院提供，加入生理鹽水配成0.5 mg/mL的混懸液。尿酸鈉溶液的制備：稱取 2500 mg尿酸鈉結(jié)晶(由 SIGMA CHEMICAL CO生產(chǎn)，購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：120k5305)加入100 mL生理鹽水，加溫?cái)嚢柚瞥蓾舛葹?5mg/mL的尿酸鈉溶液，保存于4℃冰箱，用前搖勻。

1.3 主要試劑 IL-1、IL-6 ELISA試劑盒(英國(guó)abcam生物試劑有限公司提供，批號(hào)：YI091519DS)；TNF—α ELISA試 劑 盒 ， RatTNF—alphaPlatinum ELISA(美 國(guó) e-Bioscoence)。

1.4 主要儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、電子天平、85V34超低溫冰箱、水套式CO2培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)儀、GL-20A型離心機(jī)、操作臺(tái)、培養(yǎng)板等。均由深圳市中醫(yī)院臨床細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 模型的制備 按照Mc Carty DJ經(jīng)典造模方法[1]：各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，選右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方為穿刺點(diǎn)，針口斜面朝前上方與脛骨成45°夾角穿入踝關(guān)節(jié)腔，以4.5號(hào)針頭向關(guān)節(jié)腔注入尿酸鈉溶液50 μL，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為標(biāo)準(zhǔn)，建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理模型。模型組：只造模，不用藥。空白組：不造模，不用藥，依上法注射50 μL滅菌注射用水。

1.6 給藥及取材 4組實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別按上述方法造模。造模成功后，分別予空腹灌胃藥物。痛風(fēng)顆粒組灌胃痛風(fēng)泰顆粒混懸液，戴芬組灌胃戴芬混懸液，模型組灌胃生理鹽水，空白組予常規(guī)飼養(yǎng)，不作處理。7天后檢測(cè)大鼠右內(nèi)踝關(guān)節(jié)液中的IL-1、IL-6及血清中TNF-α的含量。按照熊遠(yuǎn)珍[2]提出的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的新?lián)Q算標(biāo)準(zhǔn)，換算系數(shù)為0.16，所灌胃戴芬混懸液按9.375 mg/kg計(jì)算，痛風(fēng)泰顆?；鞈乙喊?0 mL/kg劑量灌胃，每天1次，7天后取材。取材方法：麻醉后固定，切開(kāi)右內(nèi)踝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊，用少量生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液放置于-20℃冰箱中保存待檢測(cè)[3]；斷尾采血2 mL分離血清，保存于-20℃冰箱中，測(cè)定TNF-α含量。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)與方法 觀察各組大鼠造模前后關(guān)節(jié)膚色、皮溫、腫脹情況；活動(dòng)情況；關(guān)節(jié)積液顏色、清亮度。測(cè)定大鼠IL-1、IL-6、TNF-α的含量，采用ELISA法。具體檢測(cè)步驟、方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，組間比較選用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況結(jié)果 痛風(fēng)顆粒組、戴芬組、模型組大鼠右踝關(guān)節(jié)腔注入尿酸鈉溶液1 h后即逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，皮溫升高，步態(tài)不穩(wěn)。灌胃1周后，痛風(fēng)泰顆粒組、戴芬組大鼠的紅腫狀況皆逐漸減輕，皮溫逐漸降低，步態(tài)漸穩(wěn)，關(guān)節(jié)液無(wú)色透明、質(zhì)清，而模型組關(guān)節(jié)仍有紅腫，步態(tài)不穩(wěn)，關(guān)節(jié)液呈草黃色、質(zhì)稍濁?？瞻捉M實(shí)驗(yàn)前后關(guān)節(jié)、步態(tài)無(wú)明顯變化。

2.2 各組大鼠IL-1、IL-6、TNF-α含量比較 見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著升高(P＜0.05)，提示急性痛風(fēng)模型造模成功。與模型組比較，痛風(fēng)泰顆粒組和戴芬組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。痛風(fēng)泰顆粒組與戴芬組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠IL-1、IL-6、TNF-α含量比較(±s，ng/L)

表1 各組大鼠IL-1、IL-6、TNF-α含量比較(±s，ng/L)

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別空白組模型組痛風(fēng)泰顆粒組戴芬組n 9 9 9 9 IL-1 0.056±0.086 0.125±0.013①0.064±0.020②0.062±0.014②IL-6 136.03±3.52 161.85±1.07①143.65±2.79②141.86±3.05②TN F-α 60.75±15.08 109.86±19.05①46.35±4.52②47.02±5.53②

3 討論

痛風(fēng)急性發(fā)作的機(jī)制是尿酸生成過(guò)多或/和尿酸排泄減少導(dǎo)致尿酸鹽沉積，誘發(fā)炎癥因子白三烯和糖蛋白化學(xué)趨化因子的釋放，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作。近年來(lái)，隨著痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制在分子生物學(xué)和免疫學(xué)方面研究的深入，發(fā)現(xiàn)在急性炎癥過(guò)程中，炎癥細(xì)胞、免疫球蛋白和細(xì)胞因子也隨之發(fā)生了一系列變化。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以較明顯的控制血白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素 E2(PGE2)、細(xì)胞間黏附因子-1 (ICAM-1)等細(xì)胞因子的水平，降低其表達(dá)，進(jìn)而控制其炎癥效應(yīng)，改善癥狀[4～8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)的發(fā)生，內(nèi)因多為先天稟賦不足，或過(guò)食肥甘，脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)生，濕久蘊(yùn)熱，氣血運(yùn)行不暢，熱邪壅滯經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)而致；外因?yàn)轱L(fēng)、寒、濕之邪侵襲，留著于肢體、筋骨、關(guān)節(jié)，日久化熱，濕熱邪氣痹阻經(jīng)絡(luò)和關(guān)節(jié)，不通則痛，發(fā)為本病。張劍勇教授根據(jù)多年的臨床實(shí)踐，使用痛風(fēng)泰顆粒治療痛風(fēng)濕熱蘊(yùn)結(jié)證，取得了較顯著的療效。痛風(fēng)泰顆粒由土茯苓、萆薢、川牛膝、秦艽、山慈菇、赤芍、山茱萸組成。方中秦艽祛風(fēng)濕，舒筋通絡(luò)，止痹痛；土茯苓、萆薢健脾利水，清熱解毒，祛濕降濁；山慈菇清熱解毒，宣痹止痛；赤芍清熱涼血、祛瘀止痛；山茱萸、川牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利關(guān)節(jié)。諸藥合用，能使正氣充盛，濕熱濁邪得以排出，共奏清熱祛濕、解毒化濁之功。全方清涼而不冰，化濕而不燥，宣透而不峻，祛邪不傷正，扶正不戀邪，標(biāo)本兼治，陰陽(yáng)并調(diào)?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明，山慈菇中含有秋水仙堿成分，能迅速消炎止痛，對(duì)急性痛風(fēng)有特效[9]；土茯苓、萆薢[10～11]能降低血尿酸；秦艽能溶解尿酸，緩解疼痛癥狀[12]；山茱萸能降低尿蛋白，改善腎功能[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)泰顆粒對(duì)IL-1β、IL-8、ICAM-1、TNF-α的表達(dá)均具有抑制作用[4～5]。

本次研究顯示，尿酸鈉所致的大鼠局部關(guān)節(jié)紅腫、皮溫升高及步態(tài)不穩(wěn)，與人類急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí)所表現(xiàn)的紅腫熱痛、活動(dòng)受限等癥狀相似。經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，痛風(fēng)顆粒組關(guān)節(jié)腫脹程度可明顯減輕，步態(tài)漸穩(wěn)，而且與模型組比較，IL-1、IL-6、TNF—α水平呈低表達(dá)，提示痛風(fēng)泰顆粒治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是有效的。痛風(fēng)顆粒組與戴芬組比較，二者在減輕關(guān)節(jié)腫痛、改善步態(tài)及降低IL-1、IL-6、TNF-α水平方面均具有明顯的療效，提示兩者作用效果相當(dāng)。痛風(fēng)泰顆粒治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能是與抑制IL-1、IL-6、TNF—α的表達(dá)相關(guān)，但其具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步去證實(shí)。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Tongfengtai Granules on Contents of IL-1，IL-6，TNF-α in Acute Gout Rat

ZHANG Jianyong，WANG Hui，Xie Jingjing，XIAO Min，LI Dan

Objective：To obeserve the effect of Tongfengtai granules on contents of Interleukin-1(IL-1)，Interleukin-6 (IL-6)，Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)in acute gout rat，discuss possible Mechanism.Methods：Thirty-six Sprague-Dawley(SD)rats were divided into the blank group，model group，tongfengtai granules group，difene group randomly.Except blank group，the other three groups were induced to pathological model with acute gouty arthritis.After successful modeling，seven-day drug intervention was given separately.Observed joint skin tone，skin temperature，swelling of experimental rats. Applyied euzymelinked immunosorbent assay(ELISA)to test IL-1、IL-6 contents in right ankle joint fluid，and TNF-α contents in serum.Results：Compared with the blank group，contents of IL-1，IL-6，and TNF-α in model group were increased significantly(P＜0.05)，suggesting the success of acute gout model.Compared with the model group，contents of IL-1，IL-6，and TNF-α in tongfengtai granules group and difene group were decreased significantly(P＜0.05).Compared tongfengtai granules group with difene group，the difference was not statistically significant(P＞0.05).Conclusion：Tongfengtai granules may treat gout by inhibiting release of inflammation factor IL-1，IL-6 and TNF-α.

Tongfengtai granules；Acute gout；Interleukin-1(IL-1)；Interleukin-6(IL-6)；Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)；Animal experiment；Rat

R285.5

A

0256-7415（2016）12-0201-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.086

2016-07-06

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目（JCYJ20130329155553735）

張劍勇（1964-），男，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)風(fēng)濕病。

謝靜靜，E-mail：xiaotu0901@126.com。