程曉云，李建梅

（云南省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223）

顯色培養(yǎng)基分離嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌的
效果比對和應用

程曉云，李建梅

（云南省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223）

分析廣東環(huán)凱公司阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（CRM006）和科瑪嘉阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）的實驗應用效果，為檢測嬰幼兒乳粉中的阪崎腸桿菌選用培養(yǎng)基提供依據(jù)。按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》（GB/T 4789.40-2010）分離及生化鑒定阪崎腸桿菌，并分析培養(yǎng)基的分離效果。結果表明，36份樣品中，檢出阪崎腸桿菌2份，檢出率為5.56%；CRM平板和DFI平板陽性符合率為100%；疑似菌落檢出率分別為16.67%和13.89%（P＞0.05）。CRM平板和DFI平板用于培養(yǎng)分離阪崎腸桿菌均有良好效果。

乳粉；阪崎腸桿菌；顯色培養(yǎng)基；分離鑒定效果

阪崎腸桿菌（E. sakazakii）是引起人們廣泛關注的一種危險的條件致病菌，是人和動物腸道內寄生的一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，屬腸桿菌科，腸桿菌屬，是腸道正常菌群中的一種，在1980年前一直被稱為黃色陰溝腸桿菌。阪崎腸桿菌是近幾年在乳制品中新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌。研究表明含有阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉可引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，死亡率達50%以上。因此檢測嬰兒配方奶粉及制品中的阪崎腸桿菌十分重要。

我國在2005年5月通過《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業(yè)標準的審定，對奶粉嚴查此菌。因此，按國家食品安全標準規(guī)定，阪崎腸桿菌在嬰兒配方乳粉中不得檢出。阪崎腸桿菌的檢測方法需要分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，檢測周期長，整個過程約6～7 d，且操作復雜，選擇良好的培養(yǎng)基是準確分離、早期發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌的良好方法。國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》（GB/T 4789.40-2010）規(guī)定，采用阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基作為分離該菌的培養(yǎng)基。[1]阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基是實驗室常用的檢測嬰幼兒乳粉中的阪崎腸桿菌的培養(yǎng)基，主要利用阪崎腸桿菌自身代謝產生的α-葡萄糖苷酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測。為分析國產與國外顯色培養(yǎng)基在嬰幼兒乳粉中分離阪崎腸桿菌的分離效果，筆者于2013-2015年采用廣東環(huán)凱公司阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（CRM）和河南科瑪嘉阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）同時檢測36份嬰幼兒乳粉，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣品來源

2014-2015年間，采集的嬰幼兒奶粉，共36份。樣品來自國內外不同的生產廠家，在云南省流通市場購買。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

CRM，DFI，胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），改良硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，萬古霉素（Mlst-Vm）,革蘭氏染液，阪崎腸桿菌生化鑒定試劑盒等，均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，所用的培養(yǎng)基和試劑均按操作說明書進行。選用法國梅里埃公司全自動生化鑒定系統(tǒng)對比鑒定顯色培養(yǎng)基。[2]

1.3 方法

國家標準GB/T4789.40-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》方法第一法。

（1）阪崎腸桿菌的培養(yǎng)分離及生化實驗。①前增菌和增菌：取試樣100 mL，加入已預熱至44 ℃裝有900 mL得緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，充分溶解，于（36±1）℃培養(yǎng)16～20 h。用移液管移取1 mL接種于10 mL ST-Vm肉湯中，（44±0.5）℃培養(yǎng)22～26 h。②分離：將mLST-Vm( (每 10mL mLST 溶液中加 0.1mL的萬古霉素))肉湯混勻，各取增菌培養(yǎng)液一環(huán)，分別劃線于CRM平板和DFI平板，（36±1）℃培養(yǎng)22～26 h。在CRM平板和DFI平板上，阪崎腸桿菌在兩種平板上均呈藍綠色典型菌落。挑取1～5個可疑菌落，劃線接種于TSA平板。（25±1）℃培養(yǎng)（48±4）h。③生化鑒定：自TSA平板上挑取黃色可疑菌落，進行生化試驗，結果見表1。鑒定陽性菌株為ATCC29544標準指控菌株。[3]

表1 生化試驗結果統(tǒng)計表

（2）分離鑒定。將疑似菌落分離純化，革蘭氏染色后，選用法國梅里埃公司鑒定卡（陰性卡）進行儀器生化鑒定和確認。

（3）質量控制。阪崎腸桿菌鑒定陽性菌株為ATCC29544標準指控菌株。

（4）統(tǒng)計學處理。采用SPSS21.0軟件，率的比較用Χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

36份樣品中，生長疑似菌落份數(shù)在CRM平板和DFI平板上分別為6份和5份，疑似菌落份數(shù)檢出率分別為16.67%和13.89%，差異無統(tǒng)計學意義（Χ2=0.08，P＞0.05）；在2份陽性加標樣品中，兩者結果一致，陽性符合率為100%，見表2。

表2 CRM平板和DFI平板分離阪崎腸桿菌結果比較表

3 討論

我國在頒布檢測阪崎腸桿菌國家標準前，阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI瓊脂）細菌莢膜染色法。

3.1 原理與應用

細菌莢膜是細菌細胞壁外面的一層黏液性物質，對染料的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染色，即使菌體和背景著色而莢膜不著色，因此在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜含水量在90%以上，染色時一般不用熱固定，以防莢膜皺縮變形。莢膜染色法用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌和產氣莢膜梭菌等有莢膜細菌的鑒定。[4]

3.2 材料

莢膜菌液；結晶紫酒精飽和液5 mL，加蒸餾水95 mL混合液；200 g/L硫酸銅水溶液。

3.3 方法

將莢膜菌涂片在空氣中自然干燥，不需加熱固定。滴加結晶紫染色液，在火焰上微微加熱，使玻片上染液冒蒸汽為止，用200 g/L硫酸銅水溶液沖洗染液，切勿用流水沖洗。用吸水紙吸干后油鏡觀察。

4 結果

細菌菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色或無色。阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基具有較高的選擇性和特異性，且兩種培養(yǎng)基的特異性無明顯差別，可以達到相同的靈敏度和檢測限，顯色培養(yǎng)基對阪崎腸桿菌的特異性高，抗干擾性強。

5 結語

顯色培養(yǎng)基在嬰幼兒奶粉微生物檢測中的應用，可大大提高檢出率和減少檢測時間，應用顯色培養(yǎng)基鑒定細菌是一種快捷方便易推廣的快速檢測方法，通過顯色培養(yǎng)基的特異性酶的顯色底物，直接觀察菌落顏色即可初步鑒定菌種，具有快速、簡便、節(jié)約成本等優(yōu)點。結果顯示，增菌液在37 ℃培養(yǎng)時，在顯色培養(yǎng)基上分離會出現(xiàn)假陽性的菌落，而在44 ℃培養(yǎng)時，即可排除此干擾。所以在實際檢測中仍然需要檢測人員提高對檢測樣品的前增菌方法和對阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基特異性和靈敏度的及時嚴格地按國家標準方法進行觀測，才能有效提高樣品檢測率。[5]

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T 4789.40-2010 食品微生物學檢驗 食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[2]吳清平，周艷紅，蔡芷荷.衛(wèi)生微生物特異性顯色培養(yǎng)基的研究與應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005（1）：124-126.

[3]吳清平，葉應旺，郭偉鵬，等.阪崎腸桿菌的生物學特性及其檢測技術[J].微生物學報，2006（6）：99-103.

[4]楊萬穎，祝仁發(fā)，李傳禮，等.嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌方法的改進[J].檢疫檢驗科學，2008（2）：39-42.

[5]盧勉飛，蔡芷荷，吳清平，等.阪崎腸桿菌培養(yǎng)基的應用研究[J].微生物學報，2009（11）：1789-1793.

Comparison and Application the Effect of Chromogenic Medium for the Isolation of E. sakazakii in Infant Milk Powder

Cheng Xiaoyun, Li Jianmei
(Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Yunnan Province, Kunming 650223, China)

This paper analysis the application effect of CRM006 and DFI to provide the basis for the medium selection for detection of E. sakazakii in infant milk powder. Isolation and biochemical identification the E. sakazakii according to GB/T 4789.40-2010 and analysis of the separation effect of medium. The result shows that 2 of the 36 samples has E. sakazakii, detection rate is 5.56%; CRM tablets and DFI tablet positive coincidence rate is 100%; Suspected colonies detection rate were 16.67% and 13.89% respectively (P＞0.05). CRM tablets and DFI tablet used for separation of E. sakazakii has good effect.

Milk powder; E. sakazakii; Chromogenic medium; Separation ident ification

R155.5

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.22.035