沈佳，姜北宇，章振華，李林，史愛華，葉麗娜，張建偉

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097)

雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗安全性及效力試驗

沈佳，姜北宇，章振華，李林，史愛華，葉麗娜，張建偉*

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097)

為評價以懸浮培養(yǎng)制備的雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)抗原液為組份之一的雞新城疫(ND)-傳染性支氣管炎(IB)-傳染性法氏囊病(IBD)三聯(lián)滅活疫苗的安全性及效力，實驗室制備3批疫苗，按照《中國獸藥典》附錄對疫苗進行物理性狀、無菌檢驗、安全及效力試驗。結(jié)果顯示3批次疫苗物理性狀、無菌檢驗均合格；2倍劑量注射21日齡的SPF雞，14 d后剖檢注射部位未見炎癥反應(yīng)，疫苗吸收良好，說明疫苗安全；疫苗免疫SPF雞后21 d， ND和IB 血凝抑制(HI)抗體，IBD中和抗體均合格，攻毒實驗證明，免疫雞10/10保護，對照雞5/5發(fā)病或死亡。表明以懸浮培養(yǎng)制備的IBDV抗原液生產(chǎn)的三聯(lián)滅活疫苗安全有效。

雞新城疫；傳染性支氣管炎；傳染性法氏囊病；三聯(lián)滅活苗；效力

雞新城疫(Newcastle Disease, ND)、傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)和傳染性法氏囊病(Infectious Bursa Disease, IBD)是目前危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的三種重要病毒性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。控制這3種家禽疫病的有效手段是進行疫苗的免疫接種[1-3]。傳統(tǒng)的IBDV抗原制備的采用雞胚成纖維細胞(CEF)進行增殖[4]， ND La Sota株和IB M41株抗原液采用雞胚接種，收獲雞胚尿囊液獲得，抗原液經(jīng)過滅活和超濾濃縮后按一定比例混合，制成三聯(lián)滅活疫苗[5-6]。傳統(tǒng)的IBDV抗原液制備方法工藝繁雜，滴度不高，為了提高IBDV抗原液的病毒滴度，我們引入DF-1細胞[7]替代CEF細胞，利用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)DF-1細胞生產(chǎn)IBDV抗原，并以此為組分之一制備了3批新支法三聯(lián)滅活疫苗，并對3個批次的ND-IB-IBD三聯(lián)滅活疫苗進行安全性及效力評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原制備用病毒株 NDV La Sota株：由中國獸藥監(jiān)察所保存，經(jīng)SPF雞胚增殖復(fù)壯， HA效價為1∶29～1∶210，毒價為109.0EID50/0.1 mL；IBV M41株：由中國獸藥監(jiān)察所引入凍干毒，經(jīng)SPF雞胚增殖復(fù)壯為毒種，毒價為106.5EID50/0.1 mL；IBDV BJQ902株由本研究室1990年野外分離[8]，經(jīng)SPF雞胚增殖復(fù)壯和CEF細胞傳代適應(yīng)，最后在DF-1細胞繼續(xù)傳代，建立IBDV DF-1適應(yīng)毒種，毒價為107.5～108.5TCID50/0.1 mL。

1.1.2 攻擊用強毒株 NDV北京株，毒價為108.3ELD50/0.1 mL； IBDV BJQ902囊毒株，毒價為106.0BID50/0.2 mL。

1.1.3 DF-1細胞株 購自上海艾研生物科技有限公司，由本研究室傳代保存。

1.1.4 雞胚與試驗雞 10日齡SPF雞胚和21日齡SPF雞，購自北京實驗動物中心。SPF雞胚用于毒種繁殖和毒價測定，SPF雞用于動物實驗。

1.1.5 主要試劑耗材 Cytodex 1微載體(General Electric)；DMEM高糖培養(yǎng)基；FBS胎牛血清(GIBCO)；細胞培養(yǎng)瓶(美國康寧)；硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、酪胨瓊脂(GA)、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(GP)(北京中海生物科技有限公司)；10號注射用白油(中國石化集團杭州煉油廠生產(chǎn))；司本80、吐溫80(自上海大眾制藥廠生產(chǎn))。

1.1.6 主要儀器設(shè)備 孵化器(北京海江)；隔離器(天津津航)；NBS 115 2L生物反應(yīng)器(Eppendorf)；ClassⅡA2生物安全柜(新加坡ESCO)；錐形板粘度計(美國博勒飛)；HF90 CO2培養(yǎng)箱(香港利康)；Centrifuge 5417R 臺式離心機(Eppendorf)；高壓滅菌鍋(日本三洋)；JTMS0-ABI型膠體磨(沈陽新光機械廠制造)

1.2 方法

1.2.1 抗原液制備

1.2.1.1 NDV La Sota株病毒抗原液的制備 將種毒用生理鹽水作1000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚， 每批次大約接種600枚，0.1 mL/胚，接種后在37 ℃下繼續(xù)孵化，定期照蛋，棄去24 h內(nèi)的死胚，收獲24 h～120 h的死胚及120 h活胚尿囊液，測定尿囊液的HA效價及EID50，抗原液置-20 ℃冰箱中備用。

1.2.1.2 IBV M41株病毒抗原液的制備 將種毒用生理鹽水作100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚， 0.1 mL/胚，接種后在37 ℃下繼續(xù)孵化，定期照蛋，棄去接種后24 h內(nèi)的死胚，將48 h的活胚置-4 ℃冰箱冷凍過夜，收獲尿囊液，測定EID50，置-20 ℃冰箱中備用。

1.2.1.3 IBDV BJQ902病毒抗原液的制備 2 L反應(yīng)器中加入3～4 g處理好的微載體(經(jīng)無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡過夜，115 ℃高壓滅菌30 min)以及1.5 L含5% FBS的高糖DMEM，設(shè)定溫度37 ℃，溶氧DO 40%，攪拌速度50 r/min。取18個已貼壁長滿DF-1的T225細胞瓶，胰酶消化，無菌條件下接種到反應(yīng)器中，培養(yǎng)24～36 h后，取樣顯微鏡觀察，細胞完全長滿載體表面即可接種病毒。將種毒參照楊霞等[9]的方法按0.005 MOI接種含2% FBS高糖DMEM的病毒維持液，培養(yǎng)36 h收獲病毒液，置-20 ℃冰箱中備用并測定TCID50。

1.2.2 抗原液的濃縮、滅活和滅活檢驗

1.2.2.1 病毒液的濃縮和滅活 利用姜北宇等[10]介紹的方法將檢驗合格的NDV和IBV病毒抗原液濃縮至原體積的1/4，IBDV抗原液不濃縮。濃縮抗原液以及未濃縮的IBDV抗原液加入最終濃度為2 mL/L 甲醛溶液置37 ℃恒溫搖床內(nèi)滅活16 h。分別對滅活后的病毒液取樣，進行滅活檢驗。

1.2.2.2 滅活檢驗 NDV和IBV抗原液的滅活檢驗均是取滅活后的病毒液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每種毒液接種10枚，0.2 mL/胚。37 ℃下孵育，定期照蛋，剔除24 h內(nèi)死亡雞胚，觀察5 d。5 d后接種NDV的雞胚收獲尿囊液進行HA試驗，若病毒液HA均為陰性時將毒液混合后盲傳1代，再收獲雞胚尿囊液進行HA試驗；接種IBV的雞胚5 d后取出逐個剖檢。IBDV抗原液的滅活檢驗是取滅活后的病毒液經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種10日齡SPF雞胚，共接種10枚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育，定期照蛋，剔除24 h內(nèi)死亡雞胚，觀察5 d，5 d后取出逐個剖檢，記錄陽性雞胚數(shù)。

1.2.3 滅活疫苗的制備 將經(jīng)過濃縮滅活的NDV、IBV抗原液以及未濃縮的IBDV抗原液按1∶1∶1的比例混合，以吐溫80及司本80為乳化劑，10號白油為佐劑，使用膠體磨制備油包水型疫苗，油水比為2∶1。乳化時開啟膠體磨，將油相倒入膠體磨料斗，然后緩慢加入油相的 1/2水相，進行預(yù)混，再將膠體磨間隙調(diào)小并提高膠體磨轉(zhuǎn)速乳化2.5 min，即可制備出穩(wěn)定的w/o疫苗。

1.2.4 疫苗的檢驗

1.2.4.1 物理性狀 觀察疫苗外觀情況；取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入水中，觀察疫苗擴散情況；取樣1 mL采用錐形板粘度計測定；取疫苗5 mL，裝于離心管中，以3500 r/min離心15 min，觀察疫苗分層情況。

1.2.4.2 無菌檢驗 取滅活苗1 mL接種用50 mL TG培養(yǎng)基中，置37 ℃，培養(yǎng)3 d。然后對培養(yǎng)物進行移植，分接種TG小管和GA斜面各2支，每支0.2 mL，一支置37 ℃，另一支置25 ℃。另外再取0.2 mL接種1支GP小管，置25 ℃，均培養(yǎng)5 d，觀察有無細菌生長[11]。

1.2.4.3 安全性檢驗 21日齡SPF雛雞10只，各胸肌注射疫苗0.6 mL(雙倍劑量)，觀察14 d，觀察期結(jié)束后撲殺試驗雞，進行解剖，觀察疫苗局部吸收情況及雞只各臟器的變化。

1.2.4.4 ND效力檢驗 21日齡SPF雞40只，其中免疫組3組，每組10只，健康對照和攻毒對照各5只。免疫組分別用3批三聯(lián)滅活疫苗免疫，胸肌注射20 μL/只。接種后3周對所有雞只采血，分離血清測ND HI抗體。采血后30只免疫雞和5只攻毒對照雞用NDV強毒北京株攻毒，肌肉注射105.0ELD50/只，剩余5只雞作為健康對照，觀察雞只臨床癥狀14 d。

1.2.4.5 IB效力檢驗 21日齡SPF雞35只，其中免疫組3組，每組10只，健康對照5只。免疫組30只雞用H120活疫苗經(jīng)滴鼻途徑做基礎(chǔ)免疫，1 羽份/只，基礎(chǔ)免疫3周后，采血待測IB HI抗體，采血后，分別用3批三聯(lián)滅活疫苗胸肌注射免疫，0.3 mL/只。滅活苗免疫后3周，采血分離血清，連同滅活苗免前血清一起測定IB HI抗體。1.2.4.6 IBD效力檢驗 21日齡SPF雞40只，其中免疫組3組，每組10只，健康對照和攻毒對照各5只。免疫組分別用3批三聯(lián)滅活疫苗免疫，胸肌注射疫苗0.3 mL/只。疫苗接種4周后對所有雞只采血，分離血清測定IBD中和抗體[12]，采血后免疫組雞連同攻毒對照雞5只滴鼻及口服途徑攻擊IBDV BJQ902株法氏囊強毒，0.2 mL/只(含毒106.0BID50)，攻毒后觀察3 d，記錄發(fā)病及死亡數(shù)，撲殺存活雞，逐只剖檢，觀察記錄法氏囊等病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 抗原液制備、濃縮和滅活檢驗結(jié)果

2.1.1 NDV La Sota抗原液制備、濃縮和滅活檢驗結(jié)果 將3批NDV La Sota株病毒抗原液濃縮至原體積的1/4，病毒的HA效價由1∶29～1∶210上升1∶211～1∶212，提高了兩個滴度，病毒含量則由為108.3～108.5EID50/0.1 mL上升到108.9～109.1EID50/0.1 mL；滅活的抗原液接種10日齡雞胚進行檢驗，均為陰性。結(jié)果見表1。

表1 NDV La Sota 抗原液生產(chǎn)及檢驗結(jié)果

2.1.2 IBV M41抗原液制備、濃縮和滅活檢驗結(jié)果 將3批IBV M41株病毒抗原液濃縮至原體積的1/4，病毒含量由為106.3～106.7EID50/mL上升到106.7～107.1EID50/mL，提高了兩個滴度；滅活的抗原液接種10日齡雞胚進行檢驗，均為陰性。結(jié)果見表2。

表2 IBV M41抗原液生產(chǎn)及檢驗結(jié)果

2.1.3 IBDV抗原液制備及檢驗結(jié)果 將3批采用DF-1細胞懸浮培養(yǎng)工藝制備的IBDV抗原液進行病毒含量測定，病毒含量為108.1～108.5TCID50/0.1 mL。進行滅活檢驗，結(jié)果均為陰性。表結(jié)果見表3。

表3 IBDV抗原液生產(chǎn)及檢驗結(jié)果

2.2 疫苗物理性狀和無菌檢驗結(jié)果 制備的3個批次的ND-IB-IBD三聯(lián)滅活疫苗均為乳白色油乳劑，劑型為油包水，黏度測量值為78～80 cP，3500 r/min離心15 min，底部出水均在0.5 mm 以下或不分層，疫苗無菌檢驗為陰性。所有檢驗結(jié)果都符合標準。

2.3 疫苗的安全性實驗結(jié)果 采用實驗室制備的3批ND-IB-IBD三聯(lián)滅活疫苗，以雙倍劑量(0.6 mL)接種21日齡SPF雞。結(jié)果證明，采用3批三聯(lián)苗經(jīng)皮下和肌肉接種途徑接種21日齡的SPF雛雞，10只免疫試驗雞均精神良好、飲食正常，注射部位未見異常情況，雞只生長發(fā)育正常，均未引起任何局部及全身反應(yīng)；剖檢試驗雞，注射部位無腫脹、潰爛等異常反應(yīng)，疫苗吸收良好。

2.4 疫苗的效力試驗結(jié)果

2.4.1 ND-IB-IBD三聯(lián)苗ND部分效力試驗 3批疫苗免疫接種3周后采血測ND HI抗體，免疫組抗體平均滴度為4.1～4.3 log2；對照組抗體平均滴度為2.4 log2。免疫雞連同對照雞用NDV強毒北京株攻擊，每只肌肉注射105.0EID50，免疫組攻毒保護率均是100%；攻毒對照組全部死亡。結(jié)果見表5。

表5 三聯(lián)苗ND部分效力試驗結(jié)果

*保護率=(攻毒對照陽性率-免疫組陽性率)/攻毒對照陽性率×100%

2.4.2 ND-IB-IBD三聯(lián)苗IB部分效力試驗 用H120活疫苗經(jīng)滴鼻途徑免疫21日齡SPF雞， H120免后3周IB HI抗體達到4.2～4.6 1og2(1∶18～1∶24)，三聯(lián)苗加強免疫后3周， IB HI抗體明顯上升，達7.2～8.4 log2(1∶147～1∶337)，是免疫前的3倍以上。

表6 三聯(lián)苗IB部分效力試驗結(jié)果

2.4.3 ND-IB-IBD三聯(lián)苗IBD部分效力試驗 3批疫苗免疫接種4周后采血測IBD中和抗體結(jié)果見表7，免疫組中和抗體滴度分別為26606、25983及27622，對照組中和抗體滴度為0。對照組攻毒后雞只精神萎頓，羽毛松亂，剖檢發(fā)現(xiàn)法氏囊水腫、出血或者黃化等病理變化，5/5陽性，免疫組10/10雞未出現(xiàn)任何法式囊病的臨床和剖檢的病理變化。

表7 三聯(lián)苗IBD部分效力試驗結(jié)果

*保護率=(攻毒對照陽性率-免疫組陽性率)/攻毒對照陽性率×100%

3 討論與小結(jié)

由于傳代細胞具有無外源因子污染、易于規(guī)模化培養(yǎng)等優(yōu)點，因此利用其作為細胞基質(zhì)培養(yǎng)病毒制備的抗原具有純凈和免疫原性高的特點，接種后不良反應(yīng)輕，較為安全，伴隨著生物反應(yīng)器技術(shù)在過去的20年內(nèi)的快速騰飛， 大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞是當前各大生物公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)疫苗的首要選擇[13]。百特疫苗2002年利用Vero細胞生產(chǎn)流感疫苗，諾華公司通過MDCK細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)出甲型HIN1流感疫苗，利用33016-PF細胞生產(chǎn)流感疫苗[14]等。很多基于該項工藝的疫苗不斷問世，也在不斷啟發(fā)著我們，是不是可以對現(xiàn)有的疫苗工藝進行升級改造？此前本研究室制備的雞傳染性法氏囊疫苗是利用1990年從北京地區(qū)某雞場發(fā)病雞群分離到的超強毒株，經(jīng)SPF雞胚傳代復(fù)壯后，又在雞胚成纖維細胞(CEF)上繼續(xù)傳代，最后培育而成的細胞適應(yīng)株，毒價在106.5～7.5TCID50/0.1 mL，經(jīng)過濃縮后制成疫苗。本次試驗的IBDV抗原是采用IBDV BJQ902毒株經(jīng)過DF-1細胞適應(yīng)后感染生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的DF-1細胞培養(yǎng)所收獲的病毒液，IBDV種毒毒價≥107.5TCID50/0.1 mL，制備的抗原液毒價達到108.1～8.5TCID50/0.1 mL，抗原液的病毒含量不經(jīng)濃縮即達到了用SPF雞胚制備CEF原代細胞所制備抗原液的毒價，不經(jīng)濃縮即可用于疫苗制備。

采用DF-1細胞懸浮培養(yǎng)的方法制備IBDV抗原液，并結(jié)合傳統(tǒng)方法采用雞胚接種病毒制備的NDV和IB抗原液，共制備了3個批次的ND-IB-IBD三聯(lián)滅活疫苗樣品。在疫苗效力檢驗方面，IB部分通過先用H120活疫苗做基礎(chǔ)免疫，再用試驗用滅活苗加強免疫，IB HI抗體明顯上升，由4.2～4.6 1og2(1∶18～1∶24)，達7.2～8.4 log2(1∶147～1∶337)是免疫前的3倍以上，符合藥典的標準。ND部分的效力檢驗均采用測定免疫后血清抗體的高低來進行評價，其中ND部分免3周后，免疫組HI平均幾何滴度≥4 log2，對照組≤2 log2，符合藥典的標準。IBD部分免后4周，中和抗體平均滴度均1∶20000以上遠遠高于藥典的1∶5000。攻毒試驗證明，3批疫苗免疫組的攻毒保護率均為100%。

結(jié)果證明，采用應(yīng)用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)DF-1細胞生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病毒抗原液的新工藝可以替代傳統(tǒng)的CEF原代細胞制備IBDV抗原工藝，疫苗的免疫效果完全可以達到獸藥典中IBD部分的標準。應(yīng)用此工藝制備出的ND-IB-IBD三聯(lián)滅活疫苗對ND和IB部分的免疫效力無影響，且更加符合我國家禽市場需求，減少接種次數(shù)，免疫一次即可有效控制三種傳染病的發(fā)生與流行，降低雞群的應(yīng)激反應(yīng)，保證了農(nóng)民的增收致富。

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(編輯：李文平)

Safety and Efficacy Test to the Newcastle Disease，Infectious Bronchitis and Infectious Bursal Disease Trivalent Inactivated Vaccine

SHEN Jia, JIANG Bei-yu, ZHANG Zhen-hua, LI Lin, SHI Ai-hua, YE Li-na, ZHANG Jian-wei*

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097,China)

The purpose of this study is to evaluate the safety and efficacy of the newcastle disease, infectious bronchitis and infectious bursa disease (suspension cultured antigen) trivalent inactivated vaccine. 3 batches of vaccine were prepared in the laboratory. The physical properties, sterility test, safety and efficacy of the vaccine were tested according to the “Chinese Veterinary Pharmacopoeia”. The results showed that the physical properties, sterile test were all qualified to 3 batches of vaccine. Safety tests showed that no inflammatory response was found at the injection site and the vaccine was absorbed 14 days after double doses vaccine were injected to the 21 day old SPF chicken. Efficacy tests show that ND HI, IB HI titer and IBD neutralizing antibody titer were all qualified to the standard 21 days after vaccination. The challenge tests showed that 10/10 were protected to the immunized chickens and 5/5 were positive to the challenge chickens which had clinical symptoms or died with specific symptoms or lesions. The trivalent inactivated newcastle disease, infectious bronchitis and infectious bursa disease (suspension cultured antigen) vaccine is safe and effective.

newcastle disease; infectious bronchitis; infectious bursa disease; triple inactivated vaccine; efficacy

北京農(nóng)林科學(xué)院一般項目(QNJJ201409)

沈佳，碩士，從事獸用生物制品的工藝改進與研發(fā)。

張建偉。E-mail: jweizhang@sina.com

2016-09-21

A

1002-1280 (2016) 12-0001-06

S852.65