王東亮，聶巧，李龍飛，李宇琛，陳鴻雨，陳秀云，卜仕金

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001)

沙咪珠利對小鼠精子畸形和骨髓細(xì)胞微核的影響

王東亮1，聶巧1，李龍飛1，李宇琛1，陳鴻雨1，陳秀云2，卜仕金1

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001)

為評價(jià)沙咪珠利的安全性，對其進(jìn)行了小鼠精子畸形和骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)研究。選擇健康ICR小鼠隨機(jī)分為受試物高、中、低劑量組，陽性對照組和陰性對照組，進(jìn)行精子畸形試驗(yàn)和骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，計(jì)算精子畸形率和微核率。結(jié)果顯示，受試物各劑量組精子畸形率與骨髓細(xì)胞微核率與陰性對照組比較，差異不顯著(P>0.05)，與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明沙咪珠利對小鼠精子和骨髓細(xì)胞微核無影響，不具有遺傳毒性。

沙咪珠利；精子畸形；骨髓細(xì)胞微核

三嗪類抗球蟲藥是一種廣譜、高效、安全的化學(xué)合成藥物，能有效預(yù)防和治療雞球蟲病[1]。沙咪珠利是國內(nèi)自主研發(fā)的新型三嗪類抗球蟲藥，難溶于水，易溶于二甲基亞砜。初步研究結(jié)果表明沙咪珠利屬于低毒藥物，安全性高，抗球蟲效果好，抗球蟲指數(shù)(ACI)達(dá)150～200，且與地克珠利、妥曲珠利等三嗪類化合物無交叉耐藥現(xiàn)象，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。目前國內(nèi)外對沙咪珠利的一般毒理學(xué)進(jìn)行了研究報(bào)道，但關(guān)于沙咪珠利潛在的遺傳毒性未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠精子畸形試驗(yàn)及小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)探討沙咪珠利對小鼠遺傳毒性的影響，了解沙咪珠利作為新型抗球蟲藥是否具有致突變作用，以期為沙咪珠利新藥的充分開發(fā)和安全應(yīng)用提供毒理學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 沙咪珠利，含量98.6%，產(chǎn)品批號20130308，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供；環(huán)磷酰胺(CP)，山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：20140703，國藥準(zhǔn)字H14023686；小牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批號：130919；甲醇(分析純)，1%伊紅染色液，Giemsa染液。CX2型OLYMPUS顯微鏡、電子天平、注射器、乳頭吸管、解剖剪、鑷子、灌胃針頭。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康ICR小鼠，體重18～20 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2007-0001，使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0005。小鼠自由采食和飲水，飼料和飲水均符合動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，灌胃前停食12 h，不限制飲水。

1.3 劑量設(shè)計(jì)及分組 ICR小鼠120只，精子畸形試驗(yàn)組60只，全部為雄性；骨髓微核試驗(yàn)組60只，雌雄各半。小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)高、中、低劑量組，陽性對照組和陰性對照組，每組12只。沙咪珠利對小鼠經(jīng)口染毒的半數(shù)致死量(LD50)≥5000 mg/kg，依據(jù)沙咪珠利LD50，試驗(yàn)時(shí)設(shè)2500 mg/kg(高)、1250 mg/kg(中)、625 mg/kg(低)3個(gè)劑量組。陽性對照組選用40 mg/kg環(huán)磷酰胺，陰性對照組選用無菌水[2,4]。

1.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 各試驗(yàn)組每天給藥1次，連續(xù)5 d，首次給藥后第35天頸椎脫臼法處死小鼠，每個(gè)試驗(yàn)組選用10只小鼠，取附睪制片。低倍鏡找到背景清晰、精子重疊較少的部位，高倍鏡下檢查精子形態(tài)，每只動(dòng)物檢查1000個(gè)精子，對畸形精子進(jìn)行分類計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)精子畸形率[4-6]。1.5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 各試驗(yàn)組分別連續(xù)2次給藥，間隔時(shí)間24 h，第二次染毒后6 h頸椎脫臼法處死小鼠，取胸骨骨髓制片，選擇細(xì)胞完整、分散均勻、染色良好的區(qū)域在油鏡下計(jì)數(shù)。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，分別計(jì)算雌、雄小鼠各試驗(yàn)組的PCE/RBC比值和PCE微核率[4,5,7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠精子畸形試驗(yàn) 沙咪珠利的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果見表1，從表中可以看出，沙咪珠利的三個(gè)劑量組的精子畸形率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與陰性對照組比較,差異不顯著(P>0.05)，而陽性對照組與三個(gè)給藥劑量組、陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，差異極顯著。

組別劑量/(mg·kg-1)動(dòng)物數(shù)檢查精子數(shù)畸形精子類別無鉤香蕉形無定形胖頭尾折疊雙頭形雙尾形畸形精子總數(shù)畸形精子數(shù)(x±SD)精子畸形率/%陰性對照無菌水1010×10006421111855622022.00±1.412.12±0.13受試物25001010×10007117107875722222.20±1.752.14±0.1512501010×10006418110766721821.80±1.402.11±0.136251010×10006516118554621921.90±1.972.11±0.19陽性對照(CP)401010×1000143832421917152554454.40±3.985.07±0.35**

注：同列數(shù)據(jù)無肩標(biāo)表示試驗(yàn)組與陰性對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，**表示試驗(yàn)組與陽性對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。各組嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值(PCE/RBC)在正常范圍內(nèi)。沙咪珠利三個(gè)劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細(xì)胞(PCE)率與陰性(溶劑)對照組比較，差異不顯著(P>0.05)，而陽性對照組與試驗(yàn)組、陰性對照組微核率比較(P<0.01)，差異極顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試物同一劑量組內(nèi)雌、雄小鼠之間的微核無明顯的性別差異。

組別劑量/(mg·kg-1)動(dòng)物數(shù)檢查PCE數(shù)PCE/RBC比值PCE微核率/‰雄性雌性雄性雌性陰性對照無菌水550001.09±0.051.05±0.042.97±0.692.96±0.72高劑量2500550001.07±0.061.02±0.013.16±0.813.16±0.80中劑量1250550001.11±0.061.04±0.012.96±0.982.96±0.97低劑量625550001.06±0.041.05±0.073.16±0.862.98±0.71陽性對照(CP)40550001.08±0.071.02±0.0215.65±1.51**15.95±1.67**

3 討論與小結(jié)

精子畸形是指精子的形狀改變和畸形精子數(shù)量增多。正常情況下，人或哺乳動(dòng)物的精液中可能存在少量畸形精子[8]。正常小鼠的精子畸變范圍一般在0.8%～3.4%[9]。小鼠精子畸形試驗(yàn)可檢測環(huán)境因子對精子畸形生成、發(fā)育的影響，而且對已知的生殖細(xì)胞致突變物有高度敏感性，故此實(shí)驗(yàn)適用于檢測新型三嗪類抗球蟲藥沙咪珠利在體內(nèi)對生殖細(xì)胞的致突變作用。不同品系小鼠的精子畸形率基礎(chǔ)值差異較大，綜合統(tǒng)計(jì)分析表明ICR小鼠自發(fā)畸變率低，更適合作為小鼠精子畸形試驗(yàn)材料[10]。從精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，精子畸形主要發(fā)生在頭部，類型主要是無定型和無溝型，與蔣英芝等[11]研究結(jié)果一致。沙咪珠利各劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較差異不顯著，而與陽性對照組比較差異極顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，沙咪珠利對小鼠精子畸形無影響。馮秀娟[12]報(bào)道的妥曲珠利對小鼠精子畸形研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，張奧博等[13]報(bào)道的近年開發(fā)的新型三嗪類化合物納川珠利對小鼠精子畸形研究也有相似結(jié)果。

微核的形成往往是受到細(xì)胞遺傳毒物作用的結(jié)果，微核率的變化可反映所檢測藥物的遺傳毒性。微核試驗(yàn)是新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學(xué)安全性評價(jià)的必做試驗(yàn)[14]。余明澤等[15]研究表明胸骨骨髓的微核率高于股骨骨髓，染毒30 h的微核率高于24 h和48 h，故小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)可優(yōu)先選用胸骨髓制片染毒30 h檢測。從骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果可知，沙咪珠利各劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細(xì)胞(PCE)率與陰性(溶劑)對照組比較差異不顯著，而與陽性對照組微核率比較差異極顯著，且受試物同一劑量組內(nèi)雌、雄小鼠之間微核無明顯的性別差異。說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，沙咪珠利不能引起小鼠骨髓細(xì)胞微核增加。

小鼠精子畸形和骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)均屬于體內(nèi)試驗(yàn)，遺傳毒性試驗(yàn)同時(shí)還研究了沙咪珠利對體外中國倉鼠肺細(xì)胞染色體畸變的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示受試物組與陰性對照組比較均無差異。因此可判斷沙咪珠利不具有遺傳毒性，此結(jié)果為沙咪珠利后續(xù)的毒理研究和臨床應(yīng)用研究提供了參考資料。

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(編輯：侯向輝)

Effects of Ethanamizuril on Sperm Deformity and Bone Marrow Cell Micronucleus of Mice

WANG Dong-liang1, NIE Qiao1, LI Long-fei1, LI Yu-chen1, CHEN Hong-yu1, CHEN Xiu-yun2, BU Shi-jin1

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009,China；2.MedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225001,China)

In order to evaluate the security of ethanamizuril, the sperm deformity and bone marrow cell micronucleus of ethanamizuril, healthy ICR mice were randomly divided into sample high group, sample medium group, sample low group, positive control group and negative control group, made sperm abnormality test and bone marrow micronucleus test, then calculated the sperm deformity rate and micronucleus rate. The results showed that ethanamizuril in each group was no statistical differences compared with negative control group (P>0.05). When compared with positive control group, the differences was statistically significant (P<0.01). Indicated ethanamizuril has no effect on sperm deformity and bone marrow cell micronucleus of mice, it has no genetic reproductive toxic to mice.

ethanamezuril; sperm deformity; bone marrow cell micronucleus

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)

王東亮，碩士，從事獸醫(yī)藥理及毒理學(xué)研究。聶巧，碩士，從事獸醫(yī)藥理及毒理學(xué)研究，為共同第一作者。

卜仕金。E-mail：pushijin@aliyun.com

2016-02-24

A

1002-1280 (2016) 04-0045-03

S859.796