侯軒，朱聰英，應永飛，陸春波，周煒，張航俊

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310000)

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定飼料中地克珠利的含量

侯軒，朱聰英，應永飛，陸春波，周煒，張航俊

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310000)

建立了一種測定飼料中地克珠利的高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法。以乙腈提取樣品中的待測物，正己烷除脂，離心后用高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，選擇多反應監(jiān)測(MRM)、負離子模式進行定性和定量分析。結果表明，地克珠利在0.5～100 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數(shù)≥0.999，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。地克珠利在0.5、1和5 μg/kg三個添加水平下，三種飼料的平均加標回收率在79.2%～94.5%之間，相對偏差在1.7%～14.3%之間。本方法抗干擾能力強，操作簡便，靈敏度高，適用于飼料中地克珠利的測定。

飼料；地克珠利；高效液相色譜-串聯(lián)質譜

地克珠利(DIC)為類白色或淡黃色粉末，屬于三嗪類抗球蟲藥，具有高效抗球蟲能力，廣泛應用于畜牧業(yè)中，尤其在防治雞球蟲病方面有著重大意義[1]。地克珠利具有低毒、廣譜、用量小、無交叉耐藥性等特點。2015年1月14日，歐盟發(fā)布法規(guī)(EU)2015/46，批準地克珠利作為雞和兔飼料添加劑使用，預混合劑添加量為5 g/kg，且不應與其他抗球蟲藥混合使用。我國農業(yè)部公告第168號飼料藥物添加劑使用規(guī)范中規(guī)定，地克珠利預混合劑每1 kg飼料中含地克珠利2 g或5 g，全飼料添加量為1 g/1000 kg，蛋雞產蛋期禁用。在國內，地克珠利作為獸用藥物從1996年開始大規(guī)模使用[2]，但是在地克珠利應用的過程中，濫用藥物、不遵守休藥期等不合理的使用情況較為嚴重，易引發(fā)球蟲耐藥性，帶來一系列獸藥殘留問題。因此從源頭出發(fā)，對飼料中地克珠利的含量進行監(jiān)測顯得勢在必行。

目前對地克珠利檢測研究多有報道。針對雞肉樣品，施祖灝等[3]建立了雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留HPLC檢測方法，蘇曉紅等[4]利用MISPE技術，采用高效毛線管電泳技術建立雞肉中地克珠利的殘留分析方法；De等[5]建立液相色譜法對飼料中地克珠利進行檢測，Mortier L等[6]、趙岳等[7]均選擇固相萃取裝置對飼料樣本進行凈化，液質聯(lián)用法進行檢測。本研究針對三種飼料樣本，對儀器條件及前處理方法進行優(yōu)化，成功建立了一種快速有效監(jiān)測飼料中地克珠利含量的高效液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 高效液相色譜儀(LC 30A，島津公司)、串聯(lián)三重四極桿質譜儀(TRIPLE QUAD 4500， ABSCIEX公司)；電子天平(XS-205，Mettler公司)；電子天平(SL502 N，上海民橋精密科學儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation公司)；冷凍離心機(3-18k ，Sigma公司)；振蕩器(ZD-8800，華立達公司)。

1.2 藥品與試劑 地克珠利標準品( H0130805，含量≥99.7%，100 mg，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，甲醇、甲酸、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(色譜純，購于默克公司)，乙腈(分析純，購于上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.3 溶液配制

1.3.1 地克珠利標準貯備液的配制 準確稱取適量地克珠利標準品，用N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成100 μg /mL，4 ℃保存，有效期1個月。

1.3.2 地克珠利標準工作溶液的配制 準確量取適量標準儲備溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標準工作溶液，4 ℃保存，有效期1個月。1.3.3 地克珠利基質匹配標準曲線工作液的配制 分別取空白配合飼料、預混合飼料和濃縮飼料按樣品前處理方法進行處理后，在洗脫溶液中加入適當體積標準工作溶液混合，使之成0.5、1.0、10、50、100 ng/mL基質匹配標準上機液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 方法

1.4.1 儀器條件

1.4.1.1 色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠色譜柱(Waters C18 3 μm， 3.0×150 mm)，以0.2%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.4.1.2 質譜條件 電噴霧離子源；負離子掃描，多反應監(jiān)測模式(MRM)，離子源電壓：4500 V；碰撞氣能量：高；輔助加熱氣溫度：500 ℃；氣簾氣流速：10 L/h；離子源氣流流速：Gas1 為50 L/h，Gas2為50 L/h。目標化合物MRM參數(shù)見表2。

表2 地克珠利多反應監(jiān)測條件

DP：去簇電壓，EP：碰撞室入口電壓，CE：碰撞能量，CXP：碰撞室出口電壓，333.9*為定量離子

1.4.2 樣品前處理 稱取樣品2 g(精確到0.05 g)于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，300 r/min振蕩提取10 min，10000 r/min離心10 min，轉移上清液至另一50 mL離心管中，殘渣用15 mL乙腈重復提取一次，合并兩次上清液，50 ℃氮氣吹干。加入0.2%甲酸乙腈和正己烷各2 mL，渦旋1 min，10000 r/min離心取下層，過0.22 μm微孔濾膜后液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.4.3 基質匹配標準曲線繪制 取空白配合飼料、預混合飼料和濃縮飼料按1.3.3項處理，所得溶液過0.22 μm有機濾膜，HPLC-MS/MS分析。以藥物濃度為橫坐標，地克珠利定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.4 樣品添加回收率、準確度和精密度測定 分別對配合、預混合和濃縮飼料進行0.5、1.0、5.0 μg/kg的藥物空白添加回收實驗，按1.4.2項前處理后進行HPLC-MS/MS檢測。每個濃度設5個平行，連續(xù)做3 d，計算添加回收率、日內變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化 為了獲得更高的離子強度，在MRM模式下優(yōu)化質譜條件，確定了地克珠利在多反應監(jiān)測模式下信號采集的特征離子對，具體監(jiān)測條件列于表2。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化 為了獲得較好的色譜峰型，本文對色譜柱及流動相進行了優(yōu)化。采用1.4.1.1項所述色譜柱及流動相條件，色譜行為良好，能滿足檢測要求。從標準品、加標樣品的MRM色譜圖(圖1～圖3)可見，在待測藥物出峰的位置沒有雜質干擾。

圖1 標準品的MRM圖(濃度1.0 μg/L)

2.3 標準曲線、檢出限及定量限 按1.4.2項處理三種空白飼料樣品后，高效液相色譜串聯(lián)質譜檢測，以峰面積作為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。由表3可知，在濃度為0.5～100 ng/mL濃度范圍內，線性關系良好，r>0.999，取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，取信噪比S/N=10 的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。

a：配合飼料 b：預混合飼料 c：濃縮飼料圖2 空白飼料的MRM圖

a：配合飼料 b：預混合飼料 c：濃縮飼料圖3 空白飼料添加樣品的MRM圖(地克珠利濃度1.0 μg/kg)

2.4 方法的回收率、精密度 在0.5、1.0、5.0 μg/kg濃度添加水平下對配合、預混合和濃縮飼料進行添加回收實驗，每個濃度設5個平行，連續(xù)做3 d，計算添加回收率、日內變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結果見表4。

由表4可見，配合飼料、預混合飼料、濃縮飼料中，地克珠利平均回收率在79.2%～94.5%之間，日內變異系數(shù)、日間變異系數(shù)均小于15%，方法回收率高，精密度好。

表3 配合飼料、預混合飼料和濃縮飼料中地克珠利基質匹配標準曲線及檢出限和定量限

表4 地克珠利回收率及日內、日間變異系數(shù)

3 討論與小結

3.1 色譜條件優(yōu)化 地克珠利色譜條件在多篇文獻中均有研究。楊麗萍等[8]選用乙睛∶0.1%乙酸(65∶35，V/V)等度洗脫，Ai等[9]選用乙睛∶0.1%乙酸(55∶45，V/V)，流速為等度洗脫，羅浩師等[10]選用乙睛∶0.1%甲酸梯度洗脫，劉永濤等[11]選用乙腈∶0.3%乙酸(45∶55，V/V)等度洗脫，考慮到地克珠利離子化效率以及快速檢測目的，本試驗對色譜流動相進行了研究，經過優(yōu)化條件，最后采用乙腈-0.2%甲酸水按表1梯度洗脫，地克珠利在5 min左右出峰并且峰形尖銳，達到良好的洗脫效果。

3.2 定量、定性離子的確定 根據歐盟對殘留鑒定的技術文件規(guī)定，采用液質聯(lián)用法確證動物源食品中的殘留物質需要獲得4個鑒定分(1個母離子為1.0分，1個子離子為1.5分)。地克珠利的分子結構中含有3個同位素氯，具有多個明顯的氯離子同位素峰，根據各天然同位素所占比例的不同，試驗最終選擇豐度最高的m/z405.0和m/z406.9兩個離子為母離子，之后通過對碰撞能量和碰撞室出口電壓的選擇優(yōu)化，選擇m/z333.9和m/z335.8兩個子離子分別作為各自的子離子，由于m/z333.9響應值較高，因此作為地克珠利的定量離子。這樣共獲得5個確證分，滿足歐盟對殘留物的確證檢測要求。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 Mortier L等[6]采用0.1%甲酸乙腈提取雞肉和飼料基質中的樣品，濃縮提取后，用內標法進行定量；趙岳等[7]在測定雞飼料中地克珠利含量時，采用硅膠固相萃取柱進行凈化后上機檢測。本實驗經過研究，省去固相萃取凈化步驟，而是在樣品復溶的同時加入正己烷進行提脂凈化，最后取下層澄清溶液上機檢測，結果可見空白樣品基線清晰，加標樣品峰形銳利且無其他雜峰干擾，采用外標法定量，回收率在79.2%～94.5%之間，能夠滿足檢測要求。

本實驗建立的飼料中地克珠利HPLC-MS/MS檢測方法，地克珠利的回收范圍為79.2%～94.5%，日內變異系數(shù)范圍為1.7%～9.0%，日間變異系數(shù)范圍為3.0%～14.3%，檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。該方法優(yōu)化了前處理條件，操作簡便，檢測方法靈敏度高，重現(xiàn)性強，符合獸藥殘留分析性能要求，可用于日常樣品分析。

[1] 周變華, 王宏偉, 薛飛群, 等. 地克珠利抗雞球蟲作用機理研究進展[J]. 中國家禽, 2011, 33(21): 40-42.

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[3] 施祖灝, 朱良強, 盧運站, 等. 雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留 HPLC 檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2009, 29(1): 79-81.

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(編輯：侯向輝)

Determination of Diclazurilin Feeds by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HOU Xuan，ZHU Cong-ying，YING Yong-fei，LU Chun-bo，ZHOU Wei，ZHANG Hang-jun

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrug，Hangzhou310000，China)

An analytical HPLC-MS/MS method was established for determination of diclazuril in feeds. The samples were extracted with acetonitrile, then defatted with n-hexane. The treated samples were analyzed by HPLC-MS/MS after centrifuged. The analysis was performed with Multi Reaction Monitor(MRM) in negative ion mode. The results indicated good lineartites in the concentration range from 0.5 to 100 ng/mL for diclazuril, the correlation coefficient was over 0.999. The limit of detection(LOD) and the limit of quantitation(LOQ) were 0.1 and 0.5 μg/kg,respectively. While the spiked contents of diclazuril standard at 0.5,1,5 μg/kg, the recoveries and relative standard deviations(RSD) were in range of 79.2%～94.5% and 1.7%～14.3%,respectively. With the advantages of good anti-interference ability, rapidness and sensitivity, the method adapted to the determination of diclazuril in feeds.

feeds; diclazuril; HPLC-MS/MS

侯軒，碩士研究生，從事獸藥和畜產品質量安全相關檢測研究。E-mail：zjmy607@sina.com

2016-01-08

A

1002-1280 (2016) 04-0057-05

S859.2