劉曉茂，張守軍，楊志偉，曹悅，裴崗，曹彥忠，張進(jìn)杰，崔宗巖

(秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北秦皇島 066004)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定熟制雞肉制品中金剛烷胺

劉曉茂，張守軍，楊志偉，曹悅，裴崗，曹彥忠，張進(jìn)杰，崔宗巖*

(秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北秦皇島 066004)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測定熟制雞肉制品中金剛烷胺的分析方法。樣品用乙腈提取，PXC小柱凈化，經(jīng)C18色譜柱分離，以電噴霧離子源(ESI)在正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法定量。金剛烷胺的檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.15 μg/kg，在0.3～150 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.9992。對于4種不同的熟制雞肉制品，在4個加標(biāo)水平下的平均回收率范圍為87.2%～94.8%，批內(nèi)精密度(n=6)為6.7%～10.0%，批間精密度(n=3)為8.5%～13.6%。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，適用于熟制雞肉制品中金剛烷胺殘留量的測定。

金剛烷胺；熟制雞肉制品；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，在抑制人流感病毒方面，金剛烷胺具有價格低廉，效果明顯等特點。2012年12月我國爆發(fā)“速生雞”事件，曝光雞在飼養(yǎng)過程中被違規(guī)喂食金剛烷胺抗病毒藥物，該藥物濫用不僅造成雞肉風(fēng)味和品質(zhì)的下降，更會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和藥物殘留，并通過食物鏈影響人類健康和破壞生態(tài)平衡，造成嚴(yán)重不良后果。農(nóng)業(yè)部在2005年發(fā)布第560號公告中，明確規(guī)定抗病毒藥物為禁用獸藥[1]。由于熟制雞肉制品大多經(jīng)過油炸工序且包裹面粉，基質(zhì)比較復(fù)雜，檢測難度較大，因此建立一種簡單、實用、準(zhǔn)確、高效的測定熟制雞肉制品中金剛烷胺含量檢測方法，具有重要意義。

目前，文獻(xiàn)報道的金剛烷胺測定方法主要有熒光分光光度法[2]﹑氣相色譜法[3-5]、液相色譜法[6-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[10-11]，熒光分光光度法干擾因素較多，測量精密度差，氣相色譜法需衍生后檢測，液相色譜法靈敏度較低且無法提供結(jié)構(gòu)信息，HPLC-MS/MS法可提供待測物的結(jié)構(gòu)信息，具有較高的靈敏度和選擇性。本文采用HPLC-MS/MS法，對前處理過程中固相萃取柱的實驗條件及各影響因素進(jìn)行了較為深入的探討，采用優(yōu)化的方法對熟制雞肉制品中金剛烷胺的含量進(jìn)行了實際檢測和驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜儀(日本島津公司)；3200三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國Applied Biosystems公司)；PXC固相萃取小柱(150 mg，6 mL，迪馬公司)；TurboVap LV濃縮工作站為美國Biotage公司；SA300振蕩器(日本Yamato公司)；固相萃取裝置(天津海洋玻璃儀器廠)；渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司)；真空泵(津騰公司)。

金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(Toronto Research Chemicals 公司，純度99.5%)；金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(Toronto Research Chemicals 公司，純度99.5%)；所用溶劑或其他試劑均為分析純或色譜純；所用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10 mg金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1000 mg/L儲備液，于4 ℃條件下儲存。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10 mg金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1000 mg/L儲備液，于4 ℃條件下儲存。

1.2 樣品的提取與凈化 稱取2 g(精確至0.01 g)樣品至50 mL塑料離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL乙腈，在振蕩器上振蕩20 min，高速離心5 min(15000 r/min)。將上清液轉(zhuǎn)移至裝有10 mL 5%三氯乙酸溶液的塑料離心管中，混勻后將樣品溶液加載至預(yù)先用5 mL甲醇和10 mL水活化過的PXC固相萃取小柱上。待樣品溶液全部過柱后，分別用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，用真空泵減壓抽干，然后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯(5+47.5+47.5，V/V/V)溶液洗脫，收集洗脫液于氮吹管中，向其中加入20 μL甲酸，50 ℃氮氣吹干，用1 mL乙腈-水(25+75，V/V)溶液溶解殘渣，過0.2 μm水系濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱：Atlantis T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40 ℃；流動相A：甲酸-水(1+999,V/V)溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫條件為：初始流動相A為98%，4 min后變?yōu)?6%，5 min后降為60%，8 min后降為50%，8.1 min升至98%，保持至13 min。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5300 V；霧化氣(NEB)壓力：0.5 MPa；氣簾氣(CUR)壓力：0.35 MPa；輔助氣(AUX)壓力：0.7 MPa；輔助氣溫度(TEM)：500 ℃；碰撞室出口電壓(CXP)：3.2 V；金剛烷胺及金剛烷胺內(nèi)標(biāo)定量離子對、定性離子對、碰撞能量、去簇電壓、保留時間，見表1所示。金剛烷胺及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖見圖1。

表1 金剛烷胺及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜實驗條件

圖1 金剛烷胺(A)及內(nèi)標(biāo)(B)的MRM色譜圖(空白基質(zhì)添加，濃度均為0.3 μg/kg)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇 參考文獻(xiàn)報道的實驗條件，分別使用甲醇-1%三氯乙酸(50+50,V/V)、乙腈-1%三氯乙酸(50+50,V/V)、甲醇-5%三氯乙酸(50+50,V/V)、乙腈-5%三氯乙酸(50+50,V/V)、甲醇和乙腈作為提取液，空白基質(zhì)添加0.15 μg/kg，通過回收率來對比提取效果，結(jié)果如圖2?？梢?，采用乙腈提取的回收率最高，因而本方法選擇乙腈作為提取液。

圖2 提取液對金剛烷胺回收率的影響

2.2 凈化條件的選擇 實驗采用空白樣品加標(biāo)的方式，考察了三種固相萃取柱小柱HLB、MCX和PXC的凈化效果和回收率情況，結(jié)果表明，采用MCX和PXC的凈化效果具有較好的樣品凈化效果，可除去熟制雞肉制品樣品中大量的脂肪、蛋白質(zhì)等干擾物。而PXC小柱的回收率比MCX高，因而實驗選擇PXC為凈化柱。2.3 洗脫液的選擇 取25 mL提取液，加入0.1 μg/mL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)100 μL，混勻后分別取出5 mL過PXC固相萃取小柱，待樣液全部過柱后，分別用5 mL水和5 mL甲醇淋洗小柱，抽干，分別用5 mL 5%氨水甲醇、5%氨水甲醇-乙酸乙酯(4∶1)、5%氨水甲醇-乙酸乙酯(1∶1)、5%氨水甲醇-乙酸乙酯(1∶4)這4種洗脫液進(jìn)行洗脫，比較它們的響應(yīng)值，結(jié)果如圖3所示，5%氨水甲醇-乙酸乙酯(1∶1)響應(yīng)值最高，因此本方法選擇5%氨水甲醇-乙酸乙酯(1∶1)為洗脫液。

圖3 洗脫液的對金剛烷胺響應(yīng)的影響

進(jìn)一步對洗脫溶液用量進(jìn)行了優(yōu)化和選擇，分別用3、4、5、6、7、8 mL的5%氨水甲醇-乙酸乙酯(1∶1)洗脫液洗脫，比較它們的響應(yīng)值，結(jié)果表明，用5 mL洗脫液即可洗脫完全，因而實驗選擇洗脫溶液用量為5 mL。

2.4 甲酸加入量的選擇 實驗發(fā)現(xiàn)，洗脫液濃縮定容后測定，金剛烷胺的響應(yīng)明顯降低。而在洗脫液中加入一定體積的甲酸，再進(jìn)行濃縮，則目標(biāo)物響應(yīng)良好。實驗考察了洗脫液中加入不同含量的甲酸條件下金剛烷胺的回收率。取50 mL洗脫液，加入0.1 μg/mL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)200 μL，混勻后分別取出5 mL添加0、10、20、30、40、50 μL的甲酸，然后進(jìn)行吹干，定容，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，比較其響應(yīng)值，結(jié)果如圖4所示，在洗脫液中加入20 μL甲酸響應(yīng)值最高，因而實驗選擇甲酸加入量為20 μL。2.5 方法的檢出限、線性范圍及回收率 在優(yōu)化條件下，用陰性樣品按1.2項制作空白基質(zhì)，配制濃度分別為0.3、1.5、3.0、6.0、15.0、30.0、60.0、150.0 μg/L的金剛烷胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機測試。以金剛烷胺的質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，以金剛烷胺與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=1.56X+0.0182及相關(guān)系數(shù)r2=0.9992，線性范圍為0.3～150 μg/L。

圖4 甲酸含量對金剛烷胺響應(yīng)的選擇

根據(jù)6個空白熟制雞肉制品樣品的基線噪音值求其平均值，按信噪比S/N=3計算檢出限(LOD)，信噪比S/N=10計算定量限(LOQ)，得雞肉中金剛烷胺的LOD為0.05 μg/kg、LOQ為0.15 μg/kg。

選取雞腿肉、雞胸肉、雞翅、雞皮這4種常見熟制雞肉制品，在重復(fù)性條件下分別進(jìn)行0.15、0.30、0.75、1.50 μg/kg四個水平的加標(biāo)回收率實驗，每個水平平行測定6次，并重復(fù)3批次，結(jié)果見表2。 結(jié)果表明，本方法的平均回收率范圍為87.2%～94.8%，批內(nèi)精密度(n=6)為6.7%～10.0%，批間精密度(n=3)為8.5%～13.6%。

表2 熟雞肉制品中金剛烷胺的回收率、批內(nèi)精密度及批間精密度

3 討論與小結(jié)

本文針對目前研究較少的熟制雞肉品，建立了其中金剛烷胺檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。先前報道的金剛烷胺檢測方法[11-12]，大多檢測生雞肉樣品，基質(zhì)較為簡單、單一，且方法定量限在1.0～4.0 μg/kg之間。本文方法在優(yōu)化的條件下定量限為0.15 μg/kg，相較上述方法[13-14]具有更高的靈敏度。

樣品前處理的改進(jìn)是本文技術(shù)創(chuàng)新的重點，針對熟制雞肉制品的特性，選擇固相萃取的前處理方式，對樣品的提取條件、凈化參數(shù)等進(jìn)行了詳細(xì)的考察和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)影響熟制雞肉品中金剛烷胺回收率的關(guān)鍵因素為乙腈提取和洗脫液濃縮前甲酸的加入量，通過該實驗條件的選擇和優(yōu)化，使得本方法具有較低的檢出限，并獲得良好的回收率和精密度。本文所建立的方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于各種熟制雞肉制品中金剛烷胺的測定。

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第560號.獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄[S].

[2] 張文偉，楊梅，施杰，等. 熒光法測定片劑中金剛烷胺的含量[J]. 分析化學(xué)，2002，(4): 508-508.

[3] 樓永軍，陳爽，陶巧鳳. 毛細(xì)管柱氣相色譜法測定鹽酸金剛烷胺有關(guān)物質(zhì)[J]. 藥物分析雜志，2011，31(3): 493-495.

[4] 龔莉，王瑩瑩，王婧斯，等. GC法測定小兒氨酚烷胺顆粒中鹽酸金剛烷胺[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2014，(9): 995-997

[5] 邱婧，童達(dá)，李曉燕. 氣相色譜法測定小兒氨酚烷胺顆粒中鹽酸金剛烷胺的含量[J]. 中國藥師，2015，(6): 1067-1069

[6] 趙德華，賀凱，馬玲，等. HPLC-ELSD法測定鹽酸金剛烷胺片的含量[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2011，33(11): 1045-1046.

[7] 裴璐，張愛兵.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定鹽酸金剛烷胺片中鹽酸金剛烷胺含量[J]. 中國藥業(yè)，2012，21(24): 59-60.

[8] 馬玲，張學(xué)良，賀凱，等. HPLC-ELSD法測定鹽酸金剛烷胺顆粒中鹽酸金剛烷胺的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，(11): 2188-2190.

[9] 朱勝平，鐘華，何飛，等. 高效液相色譜法測定鹽酸美金剛烷胺片的含量[J]. 中南藥學(xué)，2005，(4): 209-210.

[10]張鑫，吳劍平，嚴(yán)鳳，等. 基于雙柱固相萃取-色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留[J]． 中國獸藥雜志，2015，49(9): 45-50.

[11]曲斌，朱志謙，陸桂萍，等. UPLC-MS/MS快速測定雞肉中金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物殘留[J]．中國獸藥雜志，2013，47(7): 50-54.

[12]云環(huán)，崔鳳云，嚴(yán)華，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J]．色譜，2013，(8): 724-728.

[13]魏秀麗，高迎春，陳玲，等. 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉組織中金剛烷胺殘留[J]. 中國獸藥雜志，2013，47(6): 53-55.

[14]尹暉，孫雷，畢言鋒，等. 雞肉和雞蛋中金剛烷胺與金剛乙胺殘留檢測UPLC-MS/MS法研究[J]. 中國獸藥雜志，2014，48(6): 32-35.

(編輯：侯向輝)

Determination of Amantadine in Cooked Chicken Products by High Performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry

LIU Xiao-mao, ZHANG Shou-jun, YANG Zhi-wei, CAO Yue, PEI Gang, CAO Yang-zhong, ZHANG Jin-jie, CUI Zong-yan*

(InspectionandQuarantineTechniqueCentre,QinhuangdaoEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Qinhuangdao，Hebei066004,China)

A method for the determination of amantadine in cooked chicken products has been developed by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).The sample was extracted by acetonitrile, then cleaned up by PXC solid phase extraction cartridge, and then separated on a C18 column and finally analyzed by HPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring (MRM) mode via positive electrospray ionization, and an internal standard calibration method was used. The limit of determination for amantadine was 0.05 μg/kg, and the limit of quantitation was 0.15 μg/kg. The calibration curves showed good linearity in the range of 0.3～150 μg/L with the correlation coefficient of 0.9992. The average recoveries of amantadine at 4 spiked levels, in 4 kinds of cooked chicken products, were in the range of 87.2%～94.8% with intra-assay precision of 6.7%～10.0% (n=6), and inter-assay precision of 8.5%～13.6% (n=3). The method is accurate and sensitive, which is suitable for the determination of amantadine in cooked chicken products.

amantadine; cooked chicken products；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

劉曉茂，高級工程師，碩士，從事食品安全檢測研究。

崔宗巖。E-mail: ciqqhd@126.com

2016-02-14

A

1002-1280 (2016) 04-0052-05

S859.84