張英楠，楊樹寶，單春蘭，胡慶花，孫播東，劉洪章

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118；2. 長春科技學院，長春 130600；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118)

刺五加多糖對雛雞脾臟中T、B淋巴細胞定位分布的影響

張英楠1, 2，楊樹寶3，單春蘭3，胡慶花3，孫播東3，劉洪章1*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118；2. 長春科技學院，長春 130600；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118)

為了研究雛雞注射不同濃度刺五加多糖(ASPS)后脾臟中T、B淋巴細胞定位分布的變化情況，將60 只1 日齡雛雞隨機分為3組：對照組、低劑量組和高劑量組，每組20只，10日齡起對低、高劑量組雛雞分別皮下注射免疫50和200 mg/mL的ASPS 0.2 mL，對照組雛雞以相同方式注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射4 d。于末次免疫后第7天和第14 天，從每組中分別隨機選取5只雛雞，取其脾臟制作冰凍切片，采用免疫組織化學方法檢測CD3+T淋巴細胞和Bu-1+B淋巴細胞的定位分布。結(jié)果顯示，與對照組比較，低、高劑量組在注射后的7 d和14 d ASPS均能增加脾臟中CD3+T淋巴細胞和Bu-1+B淋巴細胞的數(shù)量，由CD3+T淋巴細胞構(gòu)成的脾臟特征性結(jié)構(gòu)-動脈周圍淋巴鞘(PALS)的面積也顯著增加，紅髓中CD3+T淋巴細胞也明顯增多，分布范圍逐漸增加；同時，由Bu-1+B淋巴細胞構(gòu)成的橢球周圍淋巴鞘(EALS)的面積也明顯增加，紅髓和白髓中的漿細胞數(shù)量顯著增多，并在注射后14 d時出現(xiàn)生發(fā)中心。與對照組比較，高劑量組和注射后14 d時上述變化趨勢更為明顯。結(jié)果表明，ASPS能夠增加脾臟中T、B淋巴細胞的數(shù)量，并且能夠影響其在PALS、EALS等脾臟特征性結(jié)構(gòu)中的定位分布，從而從組織學角度進一步證明ASPS對雞免疫功能具有顯著的增強作用。

刺五加多糖；雛雞；脾臟；T淋巴細胞；B淋巴細胞；定位分布

刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖，體內(nèi)外多項研究均表明其具有調(diào)節(jié)動物免疫機能、抗氧化、抗腫瘤和抗感染等功效[1-3]。目前對于刺五加多糖的研究多集中于人類醫(yī)學領(lǐng)域，其在畜禽業(yè)上的應用研究較少。刺五加是吉林省長白山地區(qū)物美價廉的道地藥材，因此結(jié)合刺五加的功效，將其應用于畜禽防治疾病和養(yǎng)殖具有重要意義。目前ASPS作為免疫增強劑對雞免疫功能調(diào)節(jié)的研究，大多集中在ASPS對免疫器官指數(shù)、抗體效價、淋巴細胞轉(zhuǎn)化率等方面[4]，也有個別學者應用流式細胞術(shù)研究了ASPS對小鼠血液中淋巴細胞亞群數(shù)量變化的影響[5]。但是，目前關(guān)于ASPS對免疫器官中T、B淋巴細胞定位分布的影響還未見報道。脾臟是雞體內(nèi)最大的外周免疫器官，其內(nèi)存在機體免疫系統(tǒng)中最主要的免疫活性細胞T、B淋巴細胞，除直接介導細胞免疫和體液免疫功能外，他們還能互相調(diào)節(jié)共同對機體起防御作用[6]。T、B淋巴細胞數(shù)量及其定位分布的變化將直接影響免疫功能的變化。

本研究擬通過觀察ASPS對雞脾臟中CD3+T淋巴細胞和Bu-1+B淋巴細胞定位分布的影響，從組織學和細胞學角度觀察ASPS的免疫調(diào)節(jié)作用，為進一步探討ASPS的免疫功能調(diào)節(jié)機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 原料刺五加葉購自長春市福百草大藥房，由吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院李偉副教授鑒定為刺五加葉。采用水提醇沉法提取ASPS，苯酚-硫酸法測得多糖純度為81%。

冰凍切片用OCT組織包埋液,美國Sakura公司產(chǎn)品(批號：H90548328)；小鼠抗雞CD3、Bu-1單克隆抗體,美國Southern Biotechnology公司產(chǎn)品(批號：D989-3689B和D989-3273R)；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901,福州邁新公司產(chǎn)品(批號：1505229701)。

Leica CM1850 冰凍切片機,德國Leica公司生產(chǎn)；Olympus CX41 顯微鏡,日本Olympus公司生產(chǎn)；Pixera pro150ES圖像采集器,美國Pixera公司生產(chǎn)。

1.2 試驗動物的分組及處理 60只1日齡海蘭褐公雛，購自長春市農(nóng)業(yè)科學研究院種雞場。常規(guī)飼養(yǎng)管理。飼養(yǎng)至10 d時隨機分成3組，對照組、低劑量試驗組和高劑量試驗組，每組20只。對照組雞皮下注射生理鹽水，0.2 mL/只，低劑量試驗組和高劑量試驗組分別皮下注射50 mg/mL和200 mg/mL的ASPS，0.2 mL/只，每日1次, 連注4 d，根據(jù)參考文獻[7]確定了以上注射劑量。

每一組分別在最后一次注射ASPS后的第7天和第14天取材，每組分別隨機選取10只雛雞，快速取其脾臟。將脾臟制成冰凍切片，片厚5 μm，-80℃保存?zhèn)溆茫赃M行免疫組織化學染色，從而觀察T、B淋巴細胞的定位分布情況。

1.3 免疫組織化學染色程序 每組每只雞隨機選取5張切片，每張切片滴加30 mL/L過氧化氫，室溫下孵育10 min； PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞CD3(1∶200)和Bu-1(1∶200)單克隆抗體工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每張切片滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每張切片加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木精復染；自來水沖洗返藍；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片；照相。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計學處理 應用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測定脾臟中單位視野內(nèi)陽性細胞面積。每張切片測3個視野，取平均值。應用SPSSl8.0軟件對各組陽性細胞進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CD3+T淋巴細胞定位分布的變化情況 ASPS給藥后7 d時，與對照組比較，低劑量組CD3+細胞的數(shù)量顯著增多(P﹤0.05)，CD3+細胞聚集的個別單個動脈周圍淋巴鞘面積明顯增加，而且陽性細胞著色更深，白髓和紅髓中散在的陽性細胞也明顯增多(圖1B)。而高劑量組CD3+細胞的數(shù)量增加更為顯著(P﹤0.05)(圖2A)，動脈周圍淋巴鞘的數(shù)目增多(圖1C)，與低劑量組只有個別動脈周圍淋巴鞘面積增加不同(圖1B)，高劑量組大多數(shù)動脈周圍淋巴鞘面積均明顯增加，而且陽性細胞分布更加密集，另外在紅髓大血管周圍也出現(xiàn)較多CD3+細胞聚集(圖1C)。

隨著日齡增加，ASPS給藥后14 d時，低劑量和高劑量組CD3+細胞的數(shù)量均顯著增多(P﹤0.05)，增加趨勢明顯高于給藥后7 d(圖2A)。與對照組比較，低劑量組除了動脈周圍淋巴鞘面積增加外，變化最大的是紅髓和白髓中的陽性細胞分布范圍明顯增加，而且這種增加趨勢明顯高于免疫后7日齡的低劑量組(圖1E和圖1B)。尤其是此時的高劑量組，單個周圍淋巴鞘面積特別大，幾乎占據(jù)了單個視野的1/4，而且除動脈周圍淋巴鞘以外，白髓中其他部位也聚集大量CD3+細胞，這些陽性細胞形態(tài)較大，著色較深(圖1F)。

2.2 Bu-1+B淋巴細胞定位分布的變化情況 ASPS給藥后7 d時，與對照組比較，低劑量組脾臟中Bu-1+細胞的數(shù)量雖有所增加，但變化并不顯著(P﹥0.05)(圖2B)，而且紅髓中由Bu-1+B細胞構(gòu)成的橢球周圍淋巴鞘數(shù)目變化不大，但是單個橢球周圍淋巴鞘內(nèi)Bu-1+B淋巴細胞的分布更加集中，而且濃染，另外在除橢球外的紅髓其它區(qū)域以及白髓中出現(xiàn)許多陽性細胞(圖1H)。相比于低劑量組，高劑量組的這種變化趨勢更加明顯，脾臟中Bu-1+細胞的數(shù)量顯著增加(P﹤0.05)(圖2B)，橢球動脈周圍淋巴鞘的數(shù)目顯著增多，而且許多橢球已經(jīng)相互靠近，匯集成群。單個周圍淋巴鞘的面積也明顯增加，紅髓和白髓中散在的陽性細胞明顯增多，而且這些散在的陽性細胞形態(tài)較大、著色較深，即為漿細胞(圖1I)。

隨著日齡增加，ASPS給藥后14 d時，低劑量和高劑量組Bu-1+B細胞的數(shù)量均顯著增多(P﹤0.05)(圖2B)，與T淋巴細胞相似，增加趨勢明顯高于給藥后7日齡。隨著日齡增長，免疫后14日齡對照組與免疫后7日齡比較，無論是橢球周圍淋巴鞘的數(shù)量還是單個面積都明顯增加，可以看出，脾臟中B淋巴細胞的相關(guān)結(jié)構(gòu)具有明顯的增齡性變化(圖1G和圖1J)。與對照組比較，給藥后14 d低劑量組，Bu-1+B細胞的數(shù)量顯著增多(P﹤0.05)(圖2B)，區(qū)別于給藥后7日齡低劑量組，給藥后14日齡低劑量組的紅髓和白髓中就出現(xiàn)許多陽性反應的漿細胞，尤其是較早地出現(xiàn)了生發(fā)中心(圖1K)。與低劑量組相比較，此時的高劑量組，部分橢球已經(jīng)匯集到一起，形成面積特別大的橢球周圍淋巴鞘，占據(jù)了幾乎所有的紅髓部分，另外在大血管周圍也聚集了大量的漿細胞(圖1L)。

3 討論與小結(jié)

T、B淋巴細胞是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的主要細胞群體，分別調(diào)節(jié)機體的細胞和體液免疫應答, 是適應性免疫系統(tǒng)的主要效應細胞。多糖能調(diào)節(jié)T、B細胞周期，刺激其分裂增殖，并促進相關(guān)細胞因子和抗體的分泌[8]。目前多糖對T、B淋巴細胞免疫功能的調(diào)節(jié)主要通過檢測淋巴細胞增殖能力、抗體效價以及相關(guān)細胞因子等方法進行的，但是對T、B淋巴細胞在免疫器官及組織中的精確定位變化鮮有報道。由于結(jié)構(gòu)是功能的基礎，要深入揭示多糖對T、B淋巴細胞免疫功能的調(diào)節(jié)機制，研究淋巴細胞在組織中的定位、增殖和遷移等動態(tài)變化具有重要意義，因此本研究選擇靶動物雞和長白山的道地藥材刺五加為研究對象，對注射ASPS后雞脾臟中的T、B淋巴細胞定位分布的變化情況進行了研究。

A、B和C分別為給藥后7 d對照組、低劑量組和高劑量組CD3+細胞的分布情況;D、E和F分別為給藥后14 d對照組、低劑量組和高劑量組CD3+細胞的分布情況;A-F圖中細箭頭所示為動脈周圍淋巴鞘，粗箭頭所示為紅髓中陽性細胞，C圖中的虛箭頭所示為大血管周圍的陽性細胞；G、H和I分別為給藥后7 d對照組、低劑量組和高劑量組Bu-1+細胞的分布情況;J、K和L分別為給藥后14 d對照組、低劑量組和高劑量組Bu-1+細胞的分布情況;G-L圖中細箭頭所示為橢球周圍淋巴鞘;粗箭頭所示為紅髓和白髓中陽性細胞;K圖中虛箭頭所示為生發(fā)中心;L圖中虛箭頭所示為大血管中的陽性細胞圖1 刺五加多糖對脾臟中T、B淋巴細胞定位分布的影響(250×)

A：CD3+ T細胞的數(shù)量變化；B：Bu-1+ B細胞的數(shù)量變化不同字母表示差異顯著(P﹤0.05)圖2 刺五加多糖對脾臟中T、B淋巴細胞數(shù)量的影響

脾臟作為雞體內(nèi)的最大的外周免疫器官對T依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應答是通過動脈周圍淋巴鞘和橢球周圍淋巴鞘之間的相互作用誘導產(chǎn)生的[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASPS能夠明顯促進由CD3+T淋巴細胞構(gòu)成的動脈周圍淋巴鞘和由Bu-1+B淋巴細胞過程的橢球周圍淋巴鞘的發(fā)育，能夠分別增加CD3+T淋巴細胞和Bu-1+B淋巴細胞的數(shù)量、分布密度和范圍。這實際上是直觀顯示了ASPS對T、B淋巴細胞在實體組織中的增殖促進情況，這與ASPS能夠體外促進淋巴細胞增殖的研究結(jié)果一致[10-12]。另外ASPS促進脾臟的這些特征性結(jié)構(gòu)以及細胞的增殖，必然會導致脾臟指數(shù)的增加。

本研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞和B淋巴細胞在ASPS影響下的分布趨勢和變化強度有所不同，與對照組比較，低劑量的ASPS在給藥后7 d T淋巴細胞的數(shù)量以及定位分布就呈現(xiàn)比較顯著的變化，而B淋巴細胞在此時變化較小，但是高劑量的ASPS在給藥后7 d以及低劑量的ASPS在到給藥后14 d均能促進B淋巴細胞的數(shù)量增加和定位分布。本研究證明ASPS對T、B淋巴細胞的增殖和定位分布均有影響，而Han等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASPS能直接刺激B細胞的增殖、分化及抗體生成，但對T細胞的增殖及IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的表達無影響，但更多的研究結(jié)果還是證明ASPS能夠促進T細胞的增殖以及細胞因子的分泌[7]。研究結(jié)果不同可能是與ASPS對T、B淋巴細胞刺激時，實時的信號的轉(zhuǎn)導途徑和通路受ASPS的劑量、給藥時間點以及個體等因素不同有關(guān)，具體機制還有待于進一步研究。

本研究同時發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量ASPS均能誘導脾臟紅髓和白髓中產(chǎn)生形態(tài)較大、濃染的漿細胞。中藥多糖不僅可以增強淋巴細胞增殖能力，而且可增加細胞因子的分泌，有些細胞因子如IFN-γ可增強抗原提呈細胞與T細胞相互作用，增加了抗原的呈遞，從而刺激B淋巴細胞增殖為漿細胞，進而促進抗體產(chǎn)生[14]。很多研究都證明，多糖能夠促進雞細胞因子的分泌以及新城疫等疫苗免疫后抗體的產(chǎn)生[15-17]，因此研究通過免疫組化觀察到ASPS促進脾臟中漿細胞的產(chǎn)生，是對ASPS促進抗體產(chǎn)生的進一步印證。

通過觀察雛雞注射不同濃度ASPS后脾臟中T、B淋巴細胞定位分布的變化情況，表明ASPS能夠增加脾臟中T、B淋巴細胞的數(shù)量，并且能夠影響其在PALS、EALS等脾臟特征性結(jié)構(gòu)中的定位分布，從而從組織學角度進一步證明ASPS對雞免疫功能具有顯著的增強作用。

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(編輯：陳希)

Effects of Acanthopanax senticosus Polysaccharide on Distribution of T and B Lymphocytes in Chicken Spleen

ZHANG Ying-nan1,2, YANG Shu-bao3, SHAN Chun-lan3, HU Qing-hua3, SUN Bo-dong3, LIU Hong-zhang1*

(1.CollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun，130118,China; 2.ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun, 130600,China;3.CollegeofAnimalScienceandtechnology,JilinAgriculturalUniversity，Changchun, 130118，China)

The aim of this study was to investigate the effect of different concentration ASPS on distribution of T and B lymphocytes in chicken spleen. The chicks were divided into control group, low-dose group and high-dose group. There were 20 chicks in each group. The chicks in low-dose group and high-dose group respectively subcutaneous injected 0.2 mL ASPS with the dose of 50 and 200 mg/mL, The control group were administered saline and treated as the same way as the fore groups. The same operation was repeated 4 d. Five chicken spleen were removed from each group on the day 4 and 14 after the last day of immunization. The localization of T and B lymphocytes in chicken spleen were detected by Immunohistochemistry staining. The result showed the number of CD3+T lymphocytes and Bu-1+B lymphocytes in the spleen were increased in both low dose group and high dose group compared with the control group after injection for 7 d and 14 d. The area of periarterial lymphatic sheath which was composed of CD3+T lymphocytes was also increased, meanwhile CD3+T lymphocytes in the red pulp also increased obviously, and the distribution range gradually increased. At the same time, the area of periellipsoid lymphatic sheath which is composed of Bu-1+B lymphocytes was also increased, and the number of plasma cells in red pulp and white pulp was significantly increased, and even the germinal center were appeared in 14 d after injection. Compared with the control group, the change tendency of high dose group and 14 d after injection were more obvious. In conclusion, ASPS can increase the number of T and B lymphocytes in spleen, and can affect their localization in the characteristic structures of spleen like periarterial lymphatic sheath and periellipsoid lymphatic sheath, and further prove that ASPS have significant enhancement effect on immune function of chicken from the histological angle.

Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide; chick; T lymphocyte; B lymphocyte; distribution

國家自然科學基金項目(31372391)；吉林省自然科學基金項目(20150101106JC)；長春科技學院科研啟動基金

張英楠，講師，在讀博士，從事植物資源開發(fā)與利用的研究。

劉洪章。 E-mail: lhz999@126.com

2016-03-06

A

1002-1280 (2016) 04-0035-06

S853.7