賈敏，周偉，韓一嘯，梁冰，梁津豪，紀雪，孫洋，劉軍，祝令偉，陳萍，郭學(xué)軍*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122)

克氏原鰲蝦產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的分離鑒定與耐藥研究

賈敏1，周偉2，韓一嘯2，梁冰2，梁津豪2，紀雪2，孫洋2，劉軍2，祝令偉2，陳萍1，郭學(xué)軍2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122)

為了解克氏原螯蝦產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥流行情況，采集來自山東、江蘇、浙江、湖北和遼寧五省共計198份活體克氏原螯蝦腸道樣品，采用頭孢噻肟抗性選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR方法和BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)篩選、鑒定產(chǎn)ESBLs大腸桿菌并檢測其藥物敏感性。結(jié)果顯示，從198份克氏原螯蝦樣品中共分離獲得107株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，分離率為54.0%。所有分離菌株對青霉素類、一代頭孢和部分三代頭孢菌素均耐藥；對四環(huán)素類、氟喹諾酮類、氯霉素類和磺胺類藥物的耐藥率均在60% 以上(>65株)；對氨基糖苷類藥物耐藥率較低；多重耐藥(R≥3類)菌株所占比例為86.7%(96/107)，且以5類(30%，31/107)和6類耐藥(28%，30/107)為主。通過試驗初步獲得了克氏原螯蝦產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥水平的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為克氏原螯蝦細菌耐藥性防控和水產(chǎn)品公共衛(wèi)生監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

克氏原螯蝦；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌；多重耐藥

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，也稱紅沼澤蝲蛄(Red swamp crawfish)，俗稱小龍蝦，屬于淡水螯蝦[1]；它適應(yīng)能力強，生長快，食雜性，肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，是原鰲蝦屬中很有經(jīng)濟價值的品種[2]。近些年，伴隨著抗生素的大量生產(chǎn)和使用，致使細菌耐藥成為全球性的公共衛(wèi)生問題?，F(xiàn)已在多種環(huán)境介質(zhì)如土壤、水體、水生生物和細菌體內(nèi)檢測到耐藥基因的存在，且耐藥基因能通過可移動的遺傳元件在不同細菌及不同生物之間擴散、傳播，進一步對環(huán)境造成污染，危及公共健康和食品安全[3]。在多種耐藥細菌中，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，尤其是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum belta lactamase, ESBLs)腸桿菌科細菌的耐藥情況最為嚴重，對人類健康危害也最大[4]。ESBLs能鈍化所有青霉素類、頭孢類藥物包括第三代頭孢菌素(如頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶)和單酰胺環(huán)類藥物(氨曲南)的抗菌活性[5]?，F(xiàn)階段，我國對水產(chǎn)細菌耐藥性研究及監(jiān)測遠沒有對人和畜禽細菌耐藥的研究深入和系統(tǒng)[6]。因此，本研究對小龍蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進行了分離和耐藥性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小龍蝦樣品 2015年5-8月期間共采集來自山東(41份)、江蘇(81份)、遼寧(36份)、浙江(20份)和湖北(20份)五省共計198份成年活體小龍蝦樣品。

1.1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(青島海博)；ECC顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉)；頭孢噻肟200 mg標準品(139483-200204，中國藥品生物制品檢定所)；胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸粉、可溶性淀粉和酸性水解酪蛋白(英國Oxoid公司)；Mueller Hinton培養(yǎng)基(法國梅里埃公司)。

1.1.3主要儀器 BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定儀、PhoenixSpecTM比濁儀，均購自美國BD公司；PCR擴增儀(EDC-810)，購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；生物安全柜(1300A2)，購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離純化 用75%酒精棉擦拭活體小龍蝦體表，再用高壓滅菌的剪刀剪掉尾部，慢慢拔下頭部。無菌操作取出小龍蝦腸道組織移至含有500 μL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，使用無菌研磨棒室溫研磨、振蕩混勻；靜置3 min后，吸取100 μL上清液涂布于頭孢噻肟(8 μg/mL)抗性麥康凱顯色培養(yǎng)平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)14 h；每個平板上隨機挑取一個紫紅色、邊緣光滑的菌落劃線于頭孢噻肟(8 μg/mL)抗性ECC顯色培養(yǎng)平板上進行二次純化，37 ℃過夜培養(yǎng)14 h；最后挑取一個綠色單菌落接種于1 mL頭孢噻肟(8 μg/mL) LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫160 r/min震蕩過夜培養(yǎng)14 h。

1.2.2 大腸桿菌PCR鑒定 根據(jù)文獻[7]，利用大腸桿菌16S rDNA特異性引物(Fd.5’-TGTGGGAACGGCGAGTCGGAATAC-3’和Rev.5’-GGGCGCAGGGGATGAAACTCAAC-3’，由吉林庫美生物科技公司合成)對大腸桿菌分離株進行PCR鑒定。50 μL反應(yīng)體系包含：1×PCR緩沖液(含1.5 mmol/L MgCl2)，25 pmol上游、下游引物，250 μmol dNTPs，1U Taq DNA聚合酶和100 ng DNA模板。PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min， 72 ℃總延伸7 min，30個循環(huán)，4 ℃保存。使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，緩沖液為1×TAE，110 V恒壓電泳30 min,后，進行成像觀察。目的產(chǎn)物為1467 bp大小。

1.2.3 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生化鑒定和藥敏檢測 使用BD PhoenixTM-100 system全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)和雙紙片協(xié)同實驗[8]對大腸桿菌分離株進行生化鑒定、藥敏檢測和ESBLs表型確認。

1.2.4 大腸桿菌的系統(tǒng)進化分群 利用PCR方法對分離到的大腸桿菌進行分群鑒定，實驗方法參考文獻[9], PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 72 ℃總延伸7 min，30個循環(huán)，4 ℃保存，余下步驟同1.2.2?？蓪@得的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌分為五群：A、B1、B2、D和未知群，大腸桿菌分群引物序列及產(chǎn)物大小詳見表1。

表1 大腸桿菌分群鑒定引物

大腸桿菌分群鑒定引物由吉林庫美生物科技公司合成

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定 通過頭孢噻肟抗性麥康凱顯色培養(yǎng)基、抗性ECC顯色培養(yǎng)基及大腸桿菌16S rDNA 特異性PCR方法進行分離鑒定，獲得耐頭孢噻肟(8 μg/mL)大腸桿菌分離株107株。

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的鑒定 使用BD PhoenixTM-100 全自動微生物鑒定儀對107株大腸桿菌分離株進行ESBLs表型篩選，然后進行雙紙片協(xié)同實驗[8]驗證，結(jié)果107株大腸桿菌分離株均為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。

2.3 大腸桿菌分離株藥敏鑒定 根據(jù)文獻[8]，參考CLSI2012耐藥標準對107株小龍蝦大腸桿菌分離株進行氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類(下分為碳青霉烯類、一、三、四代頭孢菌素、青霉素類等類)、氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類和氟喹諾酮類6大類共計19種臨床治療常用抗菌藥物進行藥物敏感性檢測，結(jié)果見表2。107株大腸桿菌分離株對青霉素類、一代頭孢和部分三代頭孢菌素100%耐藥。對四環(huán)素類藥物的耐藥率為93.5%(100/107)；對氟喹諾酮類(60.8%，65/107)、氯霉素類(78.5%,84/107)、磺胺類(80.4%,86/107)藥物的耐藥率均在60% 以上；所有檢測菌株對碳青霉烯類藥物敏感。另外，我們又對小龍蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進行了β-內(nèi)酰胺類藥物/酶抑制劑(阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦)的藥物敏感性進行了檢測，結(jié)果107株樣品分離菌株對阿莫西林-克拉維酸(8.4%,9/107)、哌拉西林-他唑巴坦(0.9%,1/107)仍保持較好的敏感性。

表2 小龍蝦大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性結(jié)果

續(xù)表

①：氨基糖苷類藥物；②：β-內(nèi)酰胺類藥物；③：抗生素/抑制劑；④：磺胺類藥物；⑤：氯霉素類藥物；⑥：喹諾酮類藥物；⑦：四環(huán)素類藥物

在107株大腸桿菌分離株中，多重耐藥(同時對三類以上抗生素耐藥)大腸桿菌菌株有96株，占總分離株的89.7%，其中耐5類抗生素(5R)的菌株最多，占總分離株的30%(31/107)；其次是耐6類抗生素(6R)的菌株，占總分離株的28%(30/107)。多重耐藥性統(tǒng)計結(jié)果見圖1。

2.4 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群結(jié)果 大腸桿菌經(jīng)過長期進化演變成為致病群和非致病群，致病群一般為B2群和D群，非致病群一般為A群、B1群和未知群[9]。本研究中，107株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌分群結(jié)果見表3：B1群為主要優(yōu)勢群(47.66%，51/107)，A群次之(27.10%，29/107)，未知群(14.95%，16/107)、 D群(9.35%，10/107)較少，B2群(0.93%，1/107)最少；除江蘇地區(qū)以外，其他四個地區(qū)在系統(tǒng)進化分群結(jié)果上高度相似，均以B1群為主。

圖1 小龍蝦大腸桿菌不同耐藥類型菌株數(shù)

表3 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群結(jié)果

3 討論

近年來，產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細菌在亞洲呈現(xiàn)蔓延和上升趨勢。2011年報道顯示，中國71%的大腸桿菌分離株和超過一半的肺炎克雷伯菌分離株均為ESBLs陽性株[10]；2009-2010年，對從11個亞洲國家的尿路感染患者體內(nèi)分離的腸桿菌科細菌分析發(fā)現(xiàn)，有28% 是ESBLs陽性，且對三代和四代頭孢菌素耐藥率介于26%至50%之間[11]，足見其傳播、蔓延的廣泛性和嚴重性。

本研究對我國小龍蝦產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥情況進行了初步調(diào)查，從198份小龍蝦樣品中獲得107株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌分離株，對β-內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢唑林，氨芐西林，頭孢吡肟等具有較高的耐藥性，對頭孢唑林、頭孢噻肟則是完全耐藥(100%)；多重耐藥率也高達89.7%(96/107)，且以5類和6類耐藥最為普遍，這與之前報道過的雞源[12]、犬源[13]大腸桿菌多重耐藥狀況基本相似，由此可見小龍蝦體內(nèi)大腸桿菌耐藥水平高，耐藥豐度大，應(yīng)當(dāng)加強對水產(chǎn)細菌耐藥性的流行本底統(tǒng)計，重視水體環(huán)境內(nèi)細菌耐藥性擴散、傳播的危害性，同時也不能忽視水體環(huán)境的抗生素污染問題。

從地域來看，五個省份小龍蝦源大腸桿菌耐藥水平與趨勢基本一致，但也有一些不同之處，如山東省小龍蝦腸道產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對阿米卡星和阿莫西林-克拉維酸的耐藥性高于其他省份，遼寧省小龍蝦樣品中分離出的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對氨芐西林-舒巴坦的耐藥性也遠高于其他省份，這可能與不同省份該類藥物對水體污染程度有一定關(guān)系。由于本研究中部分地區(qū)的樣品數(shù)量較小，所以還需擴大樣品基數(shù)，以便提高其科學(xué)性。

本研究還對分離的大腸桿菌進行了遺傳進化分群并結(jié)合多重耐藥進行了分析。基于大腸桿菌的致病性可將大腸桿菌分為非致病群(A+B1+未知群)和致病群(B2+D)兩組，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多重耐藥的致病性大腸桿菌所占比例較小(9.4%，9/96)，耐藥性遠低于非致病性大腸桿菌(90.6%，87/96)，可見非致病菌的多重耐藥程度十分嚴重。有研究表明，攜帶耐藥基因的細菌死亡后，其耐藥基因會釋放到環(huán)境中并持久存在[14-16]。由此推斷，小龍蝦源非致病性大腸桿菌攜帶較大豐度的耐藥基因，在死亡后這些耐藥基因仍會游離在復(fù)雜的水體環(huán)境中，并隨時可能轉(zhuǎn)入其他微生物細胞內(nèi)；更為重要的是，這些細菌雖然不能致病，但是可以通過接合、轉(zhuǎn)化等方式擴大傳播范圍，造成耐藥基因的傳播、擴散，甚至可以將這些耐藥基因傳遞給致病菌[17]，這些獲得多種耐藥基因的致病性細菌一旦感染人、動物后，就會給臨床治療帶來巨大的困難，最終導(dǎo)致無藥可治。

本研究通過對克氏原鰲蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進行分離和耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)克氏原鰲蝦體內(nèi)攜帶的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有多樣性，并初步獲得了克氏原鰲蝦腸道產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，耐藥，尤其是多重耐藥情況嚴重，因此需要加強對抗生素的監(jiān)管力度，同時對水產(chǎn)品公共衛(wèi)生實施監(jiān)測并建立有效的耐藥性監(jiān)控體系。

[1] 周冬仁.克氏原螯蝦細菌性病原的分離與鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通, 2011, 27(26):102-105.[2] 夏曉飛, 鄭小婧, 王玉鳳. 不同開口餌料對克氏原螯蝦幼蝦發(fā)育及消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2011 (7): 16-21.

[3] 高盼盼, 羅義, 周啟星, 等. 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因 (ARGs) 的研究及進展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2009, 4(6): 770-779.

[4] Partridge S R. Analysis of antibiotic resistance regions in gram-negative bacteria[J]. Fems Microbiology Reviews, 2011, 35(5): 820-855.

[5] Gelband H, Miller P M, Pant S,etal. The state of the world′s antibiotics 2015[J]. Wound Healing Southern Africa, 2015, 8(2): 30-34.

[6] 王瑞旋, 馮 娟, 耿玉靜, 等. 水產(chǎn)細菌耐藥性的最新研究概況[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2010, 29(5): 770-776.

[7] Shahi S K, Singh V K, Kumar A. Detection ofEscherichiacoliand associated β-lactamases genes from diabetic foot ulcers by multiplex PCR and molecular modeling and docking of SHV-1,TEM-1, and OXA-1 β-lactamases with clindamycin and piperacillin-tazobactam[J]. Plos One, 2013, 8(7): e68234.

[8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement[S]. Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012.

[9] Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of theEscherichiacoliphylogenetic group[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(10): 4555-4558.

[10]Xiao Y, Shen P, Wei Z,etal. Mohnarin report of 2011: monitoring of bacterial resistance in China [J]. Chinese Journal of Chinese Journal of Nosocomiology, 2012, 22: 4946-4952.

[11]Lu P L, Liu Y C, Toh H S,etal. Epidemiology and antimicrobial susceptibility profiles of gram-negative bacteria causing urinary tract infections in the Asia-Pacific region: 2009-2010 results from the study for monitoring antimicrobial resistance trends (SMART)[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2012, 40: S37-S43.

[12]佟盼盼. 雞糞便菌耐藥基因及其產(chǎn) ESBLs 大腸桿菌耐藥性的研究[D]. 吉林大學(xué), 2015.

[13]趙相勝, 孫洋, 紀雪, 等. 犬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2014, 30(3): 268-272.

[14]Blum S A E, Lorenz M G,etal. Mechanism of retarded DNA degradation and prokaryotic origin of DNases in nonsterile soils[J]. Systematic and Applied Microbiology, 1997, 20(4): 513-521.

[15]Hill K E, Top E M. Gene transfer in soil systems using microcosms[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1998, 25(4):319-329.

[16]Crecchio C, Ruggiero P,etal. Binding of DNA fromBacillussubtilison montmorillonite-humic acids-aluminum or iron hydroxypolymers: Effects on transformation and protection against DNase[J]. Soil Science Society of America, 2005, 69(3): 834-841.

[17]Smet A, Martel A, Persoons D,etal. Diversity of extended-spectrum β-lactamases and class C β-lactamases among cloacalEscherichiacoliisolates in Belgian broiler farms [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52(4): 1238-1243.

(編輯：李文平)

Study on Antibiotic Resistance of Extended-Spectrum β-lactamases in Escherichiacoli Isolated from Procambarus clarkii

JIA Min1, ZHOU Wei2, HAN Yi-xiao2, LIANG Bing2, LIANG Jin-hao2, JI Xue2,SUN Yang2, LIU Jun2, ZHU Ling-wei2, CHEN Ping1, GUO Xue-jun2*

(1.FoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.InstituteofMilitaryVeterinaryScience,theAcademyofMilitaryMedicalScienceofPLA,Changchun130122,China)

In order to explore the prevalence of ESBLs-producingE.coliand the status of antibiotic resistance inProcambarusclarkii, 107 ESBLs-producingE.colifrom 198Procambarusclarkiiswere collected from five provinces in China (Shandong, Jiangsu, Zhejiang, Hubei, Liaoning). The antimicrobial susceptibility and ESBLs phenotype of these stains were determined by cefotaxime-containing medium, PCR and BD PhoenixTM-100 system. The results showed that ESBLs-producingE.coliratio was 54%. All ESBLs-producingE.colistains were resistant to penicillins, the first generation cephalosporins and part of the second generation cephalosporins. The average drug-resistance rate to tetracyclines, fluoroquinolones, chloramphenicols and sulfonamides was all above 60% (>65/107). The resistance rate to aminoglycosides was lower. All strains were sensitive to the carbapenems. Among these ESBLs-producingE.colistrains, the percentage of multi-drug resistant (R≥3classes) isolates was 86.7%(96/107), isolates with resistance to five (30%, 31/107) or six (28%, 30/107) classes of drugs were predominated. This study obtained basic data about drug-resistance in ESBLs-producingE.coli. All the results were beneficial for monitoring public hygiene of aquatic product.

Procambarusclarkii；ESBLs-producingE.coli；multi-drug resistance

國家"863"項目(2012AA022006)；軍隊醫(yī)藥衛(wèi)生課題(13CXZ024)

賈敏，碩士研究生，從事細菌耐藥性研究。

郭學(xué)軍。E-mail：xuejung@yahoo.com

2016-01-10

A

1002-1280 (2016) 04-0006-05

S852.61