刁乃超，時坤，李健明，李仲樂，姜園園，劉東旭，王春鳳，杜銳,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118；3. 教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長春 130118)

牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的亞細(xì)胞定位研究

刁乃超1，時坤2，李健明2，李仲樂1，姜園園1，劉東旭1，王春鳳1，杜銳2,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118；3. 教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長春 130118)

為深入研究牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的生物學(xué)功能，了解其在哺乳動物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況，采用RT-PCR擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒Changchun184株E2基因，將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5HisA中，并進(jìn)行酶切鑒定和測序分析，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/V5HisA-E2經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至MDBK細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察E2蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，E2蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且綠色熒光呈點(diǎn)狀均勻分布。該研究為進(jìn)一步研究牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

牛病毒性腹瀉病毒；E2蛋白；亞細(xì)胞定位

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)為牛病毒性腹瀉-黏膜病的病原，會引起牛發(fā)熱、腹瀉、急性慢性腸炎、懷孕母畜流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎、持續(xù)感染等臨床癥狀。該病傳染性強(qiáng)、感染率高，雖有疫苗應(yīng)用但仍時常爆發(fā)。目前還沒有治療該病的特效藥物[1-3]，因此應(yīng)對其致病的分子作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期尋求預(yù)防和治療該病的新途徑。

蛋白質(zhì)的代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程都與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)。病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用是病毒致病的基礎(chǔ)，成熟蛋白質(zhì)必須在特定的細(xì)胞部位才能發(fā)揮其生物學(xué)功能[4-5]。BVDV E2蛋白是一種囊膜蛋白，為BVDV的主要保護(hù)性抗原，在參與BVDV與宿主細(xì)胞的識別、吸附和介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)等過程中起重要作用[6-8]。但目前對E2基因及E2蛋白的研究主要集中在E2基因的表達(dá)和E2蛋白抗體的制備以及新型疫苗的研制方面[9-11]，在E2蛋白與宿主細(xì)胞的確切分子致病作用機(jī)制方面鮮有相關(guān)報道。因此，本試驗對BVDV E2蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 病毒、載體和細(xì)胞 牛病毒性腹瀉病毒Changchun 184株為本實(shí)驗室保存；pcDNA3.1/V5HisA真核表達(dá)載體購于Invitrogen公司；E.coliDH5α菌株由本實(shí)驗室保存；MDBK細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 15000、 DNA Marker DL 2000、DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI、T4DNA連接酶，均購自TaKaRa生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Promega公司，鼠源V5-tag Monoclonal Antibody和FITC標(biāo)記的羊抗鼠單抗購自Proteintech公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 E2基因的擴(kuò)增與克隆 根據(jù)GenBank收錄E2(登錄號：AF526380.1)基因序列設(shè)計一對引物，上游引物P1：5′- GGAATTCATGCTCCCAGCCTGTAAACCTGAC-3′，引入EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物P2：5′-CCGCTCGAGTTAACCTAAGGTCGTTTGTTCTG-3′，引入XhoI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增目的片段大小為1122 bp，引物由庫美生物技術(shù)有限公司合成。采用Trizol方法，提取BVDV基因組，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增， 反轉(zhuǎn)錄體系10 μL：MgCl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，RNase Free dH2O 3.25 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNsae Inhibitor 0.25 μL，AMV 0.5 μL，下游引物P2 0.5 μL，模板1.5 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，1個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系40 μL：5×PCR Buffer10 μL，DEPC水28.5 μL，TaKaRa Ex Taq HS 1 μL，上游引物P1 0.5 μL。將PCR反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，混勻，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。94 ℃ 30 s，60.1 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化后與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，并送庫美生物公司測序。

1.2.2 真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5HisA-E2的構(gòu)建及鑒定EcoR I和XhoI分別對pGEM-T-E2和真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5HisA雙酶切，回收目的片段后，用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，并將陽性重組質(zhì)粒送庫美生物技術(shù)有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/V5HisA-E2。

1.2.3 真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5HisA-E2的轉(zhuǎn)染 將MDBK細(xì)胞接種到鋪有蓋玻片的6孔板中，2.5×105～3×105/mL，待融合度達(dá)到70%～80%時，用FuGENE HD將重組質(zhì)粒pcDNA3.1/V5HisA-E2和pcDNA3.1/V5HisA轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中，同時設(shè)空白對照，具體操作參照說明書。

1.2.4 間接免疫熒光檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后MDBK細(xì)胞，用PBS洗3遍，每次10 min，4%多聚甲醛室溫固定12 min，PBS洗3遍，5%胎牛血清37 ℃封閉1 h，PBS洗3遍，加入鼠抗V5標(biāo)簽抗體(1∶200)4 ℃過夜，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗3遍，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗3遍，DAPI室溫染核3 min，甲醇漂洗后加入封片劑封片。用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 E2蛋白的亞細(xì)胞定位 將制備好的細(xì)胞爬片置于激光共聚焦顯微鏡下，觀察E2蛋白亞細(xì)胞定位情況。1.2.6 pcDNA3.1/V5HisA-E2表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析 取轉(zhuǎn)染48 h后MDBK細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次后加入裂解液，冰上裂解30 min，將裂解液及細(xì)胞碎片收集于1.5 mL EP管中，12000 g離心10 min，取上清20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后用脫脂奶粉封閉?？贵w孵育：一抗為鼠抗V5標(biāo)簽抗體(1∶20000)4 ℃過夜，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶3000)37 ℃孵育1 h，加入ECL顯色液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 E2基因的擴(kuò)增和克隆 以提取BVDV Changchun184株總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物大小約為1000 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。EcoR I和XhoI對 pGEM-T- E2雙酶切，獲得大小約為1122 bp的目的片段(圖2)。

2.2 真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA-E2的構(gòu)建 真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5HisA-E2經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切后，獲得片段大小正確的目的片段和載體片段(圖3)。DNA測序結(jié)果表明，E2基因已經(jīng)插入到pcDNA3.1/V5HisA載體中且方向正確，將其命名為pcDNA3.1/V5HisA-E2。

2.3 E2蛋白間接免疫熒光檢測 將制備好的細(xì)胞爬片置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，可以觀察到DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色(圖4A)，表達(dá)E2蛋白的MDBK細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光(圖4B)。表明pcDNA3.1/V5HisA-E2在MDBK細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖1 E2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組克隆載體的酶切驗證

圖3 pcDNA3.1/V5HisA-E2重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

2.4 E2蛋白的亞細(xì)胞定位分析 在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖5A、B、C)未轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均未出現(xiàn)綠色熒光；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細(xì)胞(圖5D、E、F)細(xì)胞核上和細(xì)胞質(zhì)中均呈現(xiàn)點(diǎn)狀均勻分布的綠色熒光。

圖4 pcDNA3.1/V5HisA-E2蛋白間接免疫熒光結(jié)果

圖5 pcDNA3.1/V5HisA-E2蛋白的亞細(xì)胞定位情況

2.5 E2蛋白Western blot檢測 對轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后進(jìn)行Western blot分析(圖6)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細(xì)胞樣品呈現(xiàn)單一的目的條帶(泳道3、4)，大小與預(yù)期結(jié)果相符， pcDNA3.1/V5HisA空載體(泳道2)和空白對照(泳道1)均無條帶，表明E2蛋白在MDBK細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖6 pcDNA3.1/V5-HisA-E2和pcDNA3.1/V5-HisA的Western blot分析

3 討論

本研究選擇含有V5和HisA雙標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA來研究目的蛋白的亞細(xì)胞定位情況，這與常用的含有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽的真核表達(dá)載體相比，能夠更準(zhǔn)確的顯示出目的蛋白在細(xì)胞中的分布情況，因為V5-HisA雙標(biāo)簽分子量(約2 kD)遠(yuǎn)小于GFP標(biāo)簽的分子量(約25 kD)[12]，能夠克服因大的標(biāo)簽分子量對蛋白亞細(xì)胞定位產(chǎn)生的影響。

本試驗選擇MDBK細(xì)胞作為E2蛋白表達(dá)和定位的對象，這更接近E2蛋白所在的天然宿主細(xì)胞模式，更有利于后期E2蛋白與宿主蛋白互作機(jī)制的研究。E2蛋白在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)時限由轉(zhuǎn)染預(yù)試驗確定，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72 h用倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染24 h后E2蛋白開始表達(dá)，在轉(zhuǎn)染48 h時達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，因此選擇轉(zhuǎn)染48 h的MDBK細(xì)胞做進(jìn)一步分析。

激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染48 h的MDBK細(xì)胞，結(jié)果顯示E2蛋白在細(xì)胞核上和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且綠色熒光大多呈點(diǎn)狀均勻分布。此外，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染有pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細(xì)胞有少部分出現(xiàn)變圓、皺縮的形態(tài)變化，這在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-HisA空載體和正常MDBK細(xì)胞對照組中并沒有出現(xiàn)，這很可能與E2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞凋亡或自噬有關(guān)[13]。本試驗將pcDNA3.1/V5HisA-E2轉(zhuǎn)入MDBK細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡確定E2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，為進(jìn)一步篩選與E2蛋白互作的宿主蛋白，研究二者在牛病毒性腹瀉分子致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯：李文平)

Subcellular Localization Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus E2Protein

DIAO Nai-chao1, SHI Kun2, LI Jian-ming2, LI Zhong-le1, JIANG Yuan-yuan1,LIU Dong-xu1, WANG Chun-feng1, DU Rui2,3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118 ,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 3.KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople'sRepublicofChina,LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

This experiment was designed to make a thorough study on the biological function of bovine viral diarrhea virus E2protein by investigating its subcellular localization in mammalian cells. The E2gene fragments of Changchun184 were amplified by RT-PCR, cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1/V5HisA, and then identified by restriction enzymes digestion and sequencing analysis. The subcellular location of E2protein in MDBK cells was observed by confocal laser scanning microscope after that the recombinant plasmid pcDNA3.1/V5HisA-E2was transfected into MDBK cells by lipofectin for 48 h. The results showed that the E2protein was expressed in both the nucleus and cytoplasm, and most of the green fluorescence was distributed in a speckled pattern. All of these results will be as a basis for the further research on E2protein’s functions.

bovine viral diarrhea virus; E2protein; subcelluar localization

國家自然基金(31372436)；科技部星火計劃(2014GA660004)

刁乃超，碩士，從事經(jīng)濟(jì)動物疫病的研究。

杜銳。E-mail: durui71@126.com

2016-01-19

A

1002-1280 (2016) 04-0001-05

S852.65+3