李龍飛，李宇琛，吳天興，夏良友，曹杰，王雙，卜仕金

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

犬血漿中托芬那酸高效液相色譜檢測法的建立

李龍飛1,2，李宇琛1,2，吳天興1,2，夏良友1,2，曹杰1,2，王雙1,2，卜仕金1*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

為了建立高效液相色譜(HPLC)法測定地犬血漿中托芬那酸的含量，采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相使用甲醇∶乙腈∶0.05 M醋酸鈉(pH=4.6)為36.5∶36.5∶27，流速為0.7 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為290 nm。結果: 托芬那酸的血漿藥物濃度在0.05～10.0 μg/mL范圍內，線性關系良好(r=0.9993)；最低檢出限為0.025 μg/mL；定量限為0.05 μg/mL，平均回收率為85%，批內和批間系數分別小于11%和6%。本方法簡便準確、快速可靠，適用于犬血漿中托芬那酸的藥動學和相對生物利用度研究。

高效液相色譜；托芬那酸；犬血漿

托芬那酸(TA)，N(2-甲基-3-氯苯基)-鄰氨基苯甲酸是一種非甾體抗炎藥物(NSAID)，結構與甲氯芬酸類似[1]。非甾體抗炎藥主要用于人類和動物的止痛和緩解肌肉骨骼疾病,對于治療滑膜炎、關節(jié)炎、痛風具有較強作用。它的主要作用原理為抑制環(huán)氧化酶，減少花生四烯酸向前列腺素轉化，從而抑制炎癥介質前列腺素的合成。此外，托芬那酸還能夠抑制β-葡萄糖醛酸酶、血清中血栓素B2和緩激肽誘導的腫脹。TA的甘氨酸及葡萄糖醛酸結合物形式通過尿液排泄(90%),沒有嚴重的特異性的毒性反應在獸醫(yī)臨床上具有非常廣闊的市場前景[2]。目前,對于托芬那酸血藥濃度測定方法國內報道的很少，通過研究,提供一種簡單、快速、準確的犬血漿中托芬那酸的含量的測定方法,可用于該藥物的藥動學和相對生物利用度的研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 托芬那酸標準品：含量100%，批號：BP 907-F67029，貨號Y0000154，由青島農業(yè)大學郝智慧教授饋贈；甲醇、乙腈，均為色譜純，美國TEDIA公司；醋酸，醋酸鈉，均為色譜純，德國CNW公司；超純水。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1260型高效液相色譜儀，Agilent公司；色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：成都超純科技有限公司；RE-52旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；N-EVAPTM112型干浴氮吹儀(美Organo-mation公司KS-250D超聲儀：寧波科生儀器廠；WH-1微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；TGL-16C型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。KS-250D超聲儀：寧波科生儀器廠；WH-1微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；TGL-16C型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

2 方法

2.1 血漿中托芬那酸測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶乙腈∶0.05 M 醋酸鈉(pH 4.6)=36.5∶36.5∶27，流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；紫外檢測波長：λ為290 nm。

2.1.2 標準工作液的制備 精密稱取托芬那酸標準品100 mg于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容到刻度線，及配成濃度為1000 μg/mL托芬那酸標準儲備液，-20 ℃下保存。經流動相稀釋成0.5、1、2、5、10、20、100 μg/mL標準工作液備用。

2.1.3 血漿樣品的制備與保存 犬臥姿保定后經前肢靜脈采血，采血完畢后解除保定，在規(guī)定范圍內自由活動，每次采血量約2～3 mL，給動物補充適量的5%葡萄糖生理鹽水。血樣采集后置于肝素浸潤并烘干的10 mL離心管內，3500 r/min離心10 min。血漿分離后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 血漿樣品處理 將冷凍保存的血漿室溫下自然解凍，吸取180 μL血漿，然后分別加入濃度為0.5、1、2、5、10、20、100 μg/mL托芬那酸標準工作液20 μL，渦旋2 min，分別配成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、10 μg/mL的血漿標準溶液，將200 μL的血漿標準溶液置于5 ml離心管中，加入2 mL乙腈去蛋白，混合渦旋3 min。超聲10 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，取上清于45 ℃氮氣吹干。加入200 μL流動相溶解氮氣吹干后殘渣，混合渦旋3 min，12000 r/min離心10 min，取上清25 μL進樣供HPLC分析。

2.1.5 標準曲線的制備 取7支5 mL塑料指形管，將冷凍保存的血漿室溫下自然解凍。分別加入空白犬血漿180 μL，然后分別加入濃度為0.5、1、2、5、10、20、100 μg/mL標準工作液20 μL，按2.1.4項方法處理，并進行HPLC分析。采用外標法計算，以托芬那酸峰面積(As)與對血藥濃度(C)進行加權線性回歸，得回歸方程，每個濃度重復3次。

2.1.6 檢測限和定量限 按照“2.1.4”項處理血漿樣品進樣檢測， 當儀器信噪比(S/N) =3 時， 對應樣品中的含藥濃度即為檢測限;當儀器信噪比(S/N) =10時， 對應的樣品中的含藥濃度即為定量限。

2.1.7 回收率和精密度 取空白血漿180 μL，加入托芬那酸標準工作液(0.5、10、100 μg/mL)20 μL，制成低、中、高3個質量濃度(0.05、1、10 μg/mL)的血漿樣品， 每一濃度5個樣品并測定，按2.1.4項下方法處理后進行測定，以測定值與加入值之比計算回收率， 并計算批內精密度。連續(xù) 3 d 配制并測定托芬那酸濃度，考察批間精密度。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 對濃度水平為0.05、1、5 μg/mL的5個平行穩(wěn)定性樣品執(zhí)行分析，從而評估犬血漿中托芬那酸的穩(wěn)定性。按照標準曲線制備方法分別制備上述3個濃度的空白血漿添加樣品后立刻對樣品執(zhí)行分析，以得到第0天數據；在室溫(約22 ℃)下放置4、8 h后執(zhí)行樣品分析，在凍存(約-20 ℃)一周后執(zhí)行樣品分析，在凍存(約-20 ℃)一個月后執(zhí)行樣品分析，在三個凍融循環(huán)之后執(zhí)行樣品分析。將穩(wěn)定性樣品中檢出的托芬那酸濃度與理論加標濃度做比較。

3 結果

3.1 血漿中托芬那酸檢測方法的確立

3.1.1 標準曲線 托芬那酸的血漿藥物濃度在0.05～10.0 μg/mL范圍內，血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關系(R2=0.999)。以峰面積

為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，典型的標準曲線方程為：y=63.65x+0.6054。

圖1 托芬那酸標準曲線圖

3.1.2 檢測限和定量限 取信噪比S/N≥3時濃度為最低檢測限，該方法檢測限為0.025 μg/mL；根據精密度和準確度試驗結果，取信噪比S/N≥10時濃度為最低定量限為0.05 μg/mL。

3.1.3 精密度和回收率 血漿中托芬那酸HPLC測定方法的結果表明，空白血漿添加樣品在0.05～10.0 μg/mL范圍內，批內和批間系數分別小于11%和6%，精密度良好；空白血漿中托芬那酸添加濃度在0.05、1和10 μg /mL時的回收率均在85%以上，回收率穩(wěn)定。

表1 血漿中空白添加托芬那酸相對回收率及精密度(n=5)

SD:標準偏差，RSD:相對標準偏差，n:平行數

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 對于犬血漿中的托芬那酸而言，于-20 ℃條件下凍存時能夠保持穩(wěn)定1個月，在3個凍融循環(huán)之后仍可保持穩(wěn)定，于室溫條件(約22 ℃)下儲存時可保持穩(wěn)定達4 h。

3.1.5 專屬性考察 在所建立的色譜條件下，分別得到托芬那酸標準品圖譜、空白血漿樣品的圖譜、空白血漿加入標準品后的圖譜。由圖2-圖4(橫坐標為保留時間min，縱坐標為峰面積mAU)可知，空白血漿中內源性物質不干擾托芬那酸的測定，保留時間為9.14 min。

圖2 托芬那酸(5 μg/mL)標準品色譜圖

圖3 空白犬血漿色譜圖

圖4 空白血漿添加托芬那酸標準品(5 μg/mL)色譜圖

4 討論

高效液相色譜法 (HPLC)發(fā)展迅速已成為血藥濃度檢測的最佳方法之一,其優(yōu)點是適用范圍廣,快速準確,操作簡便,樣品用量少,可同時測定多種藥物及其活性代謝物或化合物,檢測靈敏度高,一般檢出限可達ng級。為此,本文建立了犬血漿中托芬那酸的高效液相色譜檢測方法[3]。

托芬那酸因其良好的止痛和抗炎作用已被廣泛應用于不同動物[4]。目前，國外已有托芬那酸在狗、牛、羊、大鼠、犬、人體內的藥代動力學研究報道[5-8]。M.F.LANDONI等[6]用pH 3.0的枸櫞酸緩沖液酸化血漿樣品，用二乙醚提取，建立了牛血漿中托芬那酸濃度的HPLC檢測方法。P.K.Sidhu等[8]用pH 3.0的枸櫞酸緩沖液酸化血漿樣品，氯仿萃取，建立了山羊血漿中托芬那酸濃度的HPLC檢測方法。胡婷等[9]綜述了托芬那酸在大鼠，牛，羊，犬貓等物種血液、尿液等體液中的HPLC檢測方法。本試驗參考上述文獻報道，用乙腈替代了二乙醚或氯仿，建立了犬血漿中托芬那酸濃度的HPLC檢測方法。乙腈作為蛋白沉淀劑，其一可以降低水的介電系數，其二可以使大分子表面的水層脫水，相互聚集，從而使蛋白從水中析出[10]；乙腈還是良好的溶劑，托芬那酸在溶液中性質穩(wěn)定，不易析出。通過高效液相色譜紫外檢測器檢測托芬那酸的最大吸收波長發(fā)現，在波長220和290 nm附近吸收峰最大，但由于在波長220 nm附近其他雜峰干擾明顯，在波長290 nm托芬那酸吸收峰分

離明顯，無雜峰干擾，故波長定為290 nm。根據托芬那酸的弱酸性，流動相PH的選擇參考托芬那酸的PKa=4.1和綜上文獻，在PH=4.6處可保證托芬那酸的酸性官能團以單一的形式存在，從而保證了峰形的尖銳性和對稱性；醋酸鹽緩沖液的加入可使溶液變溫和，減少對色譜柱的損壞。

本試驗研究建立提取方法和色譜條件下，待測物附近無內源性物質干擾托芬那酸的測定，標準曲線在0.025～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好(R2>0.999)，最低檢測限和定量限分別為0.025 μg/mL和0.05 μg/mL；空白血漿中托芬那酸添加濃度在0.05、1和5 μg /mL時回收率均在85%以上。本實驗建立的血漿樣品中托芬那酸提取、凈化和檢測方法可用于托芬那酸注射在犬體內藥動學研究時血藥濃度測定要求。

[1] 范瑩,蘇勍. 托芬那酸原料藥中殘留溶劑頂空氣相色譜測定方法的建立[J]. 實用醫(yī)藥雜志,2014,01:54-55.

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[3] 周旭平,陸彥,張中文,沈紅,吳國娟. 血漿中連翹酯苷高效液相色譜檢測方法的建立[J]. 中國畜牧醫(yī),2009,09:26-28.

[4] 付海寧，王巧玲，殷生章. 托芬那酸的藥理毒理研究[J]. 中國獸藥雜志，2010,44(8)：52-56[5] Kruszewska H, Zareba T, Tyski S. Search of antimicrobialactivity of selected non-antibiotic drugs[J]. Acta Poloniae Pharmaceutica, 2002, 59: 436-439

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(編輯：陳希)

Determination of Tolfenamic Acid in Dog by High Performance Liquid Chromatography

LI Long-fei1,2，LI Yu-chen1,2，WU Tian-xing1,2，XIA Liang-you1,2，CAO Jie1,2，WANG Shuang1,2，BU Shi-jin1*

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUnivercity,Yangzhou225009,China;2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou225009,China)

To establish an HPLC method for quantification of tolfenamic acid in dog. The separation was performed on an Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm). Mobile phase: methanol∶acetonitrile∶0.05 M sodium acetate (pH=4.6) was 4.6∶36.5∶27．The column temperature was 35 ℃ and the detection wavelength was set at 290 nm．The velocity was 0.7 mL/min. Results: A good linear correlation was observed within the range of 0.05～10.0 μg/mL for tolfenamic acid (r=0.9993), the minimum detection limit was 0.025 μg/mL, limit of quantitation was 0.05 μg/mL; The average recovery was 85%. Within-run and between-run analysis less than 11% and 6% respectively. The method is simple，accurate and rapid．It could be suitable for dogs tolfenamic acid in plasma pharmacokinetic experiments.

HPLC; tolfenamic acid; dog plasma

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)；揚州大學“新世紀人才工程”資助項目

李龍飛，碩士研究生，從事獸藥藥理方面研究。

卜仕金。E-mail：pushijin@aliyun.com

2016-03-31

A

1002-1280 (2016) 06-0052-04

S859.79