楊忠禮，連總強(qiáng)，吳旭東,3，俞兆曦，王 燕，肖 偉，賽清云(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070； .寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，寧夏 銀川75000； 3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川75000)

蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目和鯉形目魚(yú)類中的通用性研究

楊忠禮1,2，連總強(qiáng)2,3，吳旭東1,2,3*，俞兆曦1，王 燕2，肖 偉2,3，賽清云2,3
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070； 2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，寧夏 銀川750001； 3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川750001)

為研究蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目和鯉形目魚(yú)類中的通用性，以12種不同魚(yú)類為試驗(yàn)材料，分別采用改進(jìn)的酚-氯仿法結(jié)合DNA產(chǎn)物純化試劑盒法、傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法提取其尾鰭基因組DNA，對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。結(jié)果表明，改進(jìn)的酚-氯仿法結(jié)合DNA產(chǎn)物純化試劑盒法提取的魚(yú)類基因組DNA 在純度和穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法，且電泳條帶清晰、整齊、明亮，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，便于快速、批量提取。利用蘭州鲇14對(duì)G-SSR引物和21對(duì)EST-SSR引物在12種魚(yú)類中進(jìn)行跨目通用性分析，結(jié)果顯示，蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目、鯉形目魚(yú)類的通用率分別為63.10%、32.14%和61.11%、44.44%，表明隨著物種間親緣關(guān)系變遠(yuǎn)，其通用性隨之降低。

基因組DNA； 蘭州鲇； 鲇形目； 鯉形目； G-SSR； EST-SSR； 通用性

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于PCR技術(shù)從核酸水平對(duì)魚(yú)類的起源進(jìn)化、種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性評(píng)估等研究，是目前魚(yú)類分子生物學(xué)研究的有效手段。獲得高質(zhì)量的DNA是這些分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于魚(yú)類基因組DNA提取已有較多報(bào)道[1-5],主要有3種常見(jiàn)方法：傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法[6-7]、高鹽沉淀法[8-9]、離心柱型試劑盒法[10]。傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法消化時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁瑣且穩(wěn)定性差；高鹽沉淀法操作簡(jiǎn)便快捷，但所提取的DNA純度及穩(wěn)定性較差[11]；離心柱型試劑盒提取效果較好，可以最大限度地除去蛋白質(zhì)、脂肪、及其他有機(jī)化合物對(duì)DNA的污染，但由于試劑的限制(保存、運(yùn)輸、安全等因素)，DNA提取量較少，且價(jià)格較貴[12]。一些對(duì)DNA質(zhì)量要求高的試驗(yàn)，如構(gòu)建基因組文庫(kù)、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序、Southern雜交等，傳統(tǒng)酚-氯仿法和高鹽法提取的DNA往往達(dá)不到其質(zhì)量要求?；谝陨?種方法的缺點(diǎn)和科研的需求，急需開(kāi)發(fā)一種快捷、廉價(jià)且穩(wěn)定性高的DNA提取方法。

微衛(wèi)星(microsatellites)又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，是由1～6個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)排列的DNA序列。根據(jù)其來(lái)源分為基因組SSR(genomic SSR,G-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(expressed sequence tag,EST-SSR)。微衛(wèi)星標(biāo)記因其具有共顯性遺傳、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于魚(yú)類遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的研究[13-14]。研究表明，微衛(wèi)星的側(cè)翼序列在近緣物種之間較為保守，具有通用性，根據(jù)這一特性，已有不少科研工作者利用近緣物種的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)出目標(biāo)物種的微衛(wèi)星標(biāo)記[14-16]。此外，有報(bào)道稱某些微衛(wèi)星位點(diǎn)在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間也具有一定通用性[17]。關(guān)于同一物種的G-SSR和EST-SSR在其他物種中的通用性報(bào)道較少，缺乏系統(tǒng)性比較研究。為此，本研究以12種不同魚(yú)類的尾鰭為試驗(yàn)材料，用改進(jìn)的酚-氯仿法抽提其基因組DNA，對(duì)蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)的G-SSR和EST-SSR在親緣關(guān)系較近的鲇形目(Siluriformes)魚(yú)類和親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的鯉形目(Cypriniformes)魚(yú)類中進(jìn)行通用性研究,旨在研發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、提取效果好、穩(wěn)定性高、便于批量提取的DNA提取方法，同時(shí)為蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在其他物種間的通用性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用12種魚(yú)分屬2個(gè)目，5個(gè)科，10個(gè)屬(表1)。將活魚(yú)帶回實(shí)驗(yàn)室處死，剪取部分尾鰭組織浸泡在無(wú)水乙醇中，于-20 ℃保存。

主要試劑：組織裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、 pH值8.0的0.1mol/L EDTA、pH值8.0的1% SDS)、20 mg/mL蛋白酶K、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒及海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒等均購(gòu)自天根生化試劑公司；3 mol/L NaAc、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 基因組DNA提取

分別采用改進(jìn)的酚-氯仿法結(jié)合DNA產(chǎn)物純化試劑盒法、傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法提取其尾鰭基因組DNA。

消化：將保存在無(wú)水乙醇中的蘭州鲇尾鰭組織取出，剪取30 mg左右，用干凈的濾紙將乙醇吸干后放置于1.5 mL離心管中，將組織剪碎后加入350 μL組織裂解液和8 μL蛋白酶K，充分混勻后放置在56 ℃水浴鍋中消化3～4 h，期間每隔30 min將樣品顛倒混勻1次，直至組織完全溶解并澄清。

苯酚-氯仿抽提：消化完成后加入1/5體積(約70 μL)的3 mol/L NaAc、等體積(約500 μL)的Tris-苯酚︰氯仿︰異戊醇混合液(25∶24∶1)，上下顛倒充分混勻2～5 min,使核蛋白徹底變性裂解，DNA充分溶解。充分混勻后于室溫下12 000 r/min離心10 min，吸取上清液200～250 μL至另一新的離心管中。

采用DNA純化試劑盒進(jìn)一步純化：按照普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明對(duì)上述酚-氯仿法初步抽提的DNA進(jìn)一步純化，得到高純度的DNA。由于DNA提取量較大，在洗脫步驟時(shí)，可以適當(dāng)加大洗脫液用量，提高DNA得率。

用上述方法提取20尾蘭州鲇基因組DNA并驗(yàn)證其穩(wěn)定性，用同樣的方法提取大口鲇、小口鲇、革胡子鲇、斑點(diǎn)叉尾鮰、黃顙、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鯽魚(yú)、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈基因組DNA。此外，對(duì)4尾蘭州鲇分別采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法[2]和海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA。

表1 試驗(yàn)用12種魚(yú)類的分類及采樣地

種名屬名科名目名樣品數(shù)量/尾采樣地蘭州鲇(S．lanzhouensis)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)20寧夏水產(chǎn)研究所科研基地大口鲇(S．meridionalis)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng)小口鲇(S．a(chǎn)sotus)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng)革胡子鲇(C．fuscus)胡子鲇屬(ClariasScopoli)胡子鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰(I．Punetaus)鮰屬(Ictalurus)鮰科(Ictaluridae)鲇形目(Siluriformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地黃顙(P．fulvidraco)黃顙魚(yú)屬(Pelteobagrus)鲿科(Bagridae)鲇形目(Siluriformes)1當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng)鯉魚(yú)(C．carpio)鯉屬(Cyprinus)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地草魚(yú)(C．idellus)草魚(yú)屬(Ctenopharyngodon)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地鯽魚(yú)C．a(chǎn)uratus)鯽屬(Carassius)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地白鰱(H．molitrix)鰱屬(Hypophthalmichthys)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地花鰱(A．nobilis)鳙屬(Aristichthys)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產(chǎn)研究所科研基地大鼻吻鮈(R．nasutus)吻鮈屬(Rhinogobio)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1內(nèi)蒙古澄口

1.3 DNA提取結(jié)果檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)3種方法所提取的魚(yú)類基因組DNA，電壓120 V，室溫下電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)電泳結(jié)果，并拍照保存。DNA樣品用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其含量并計(jì)算A260/A280比值。檢測(cè)完后根據(jù)需要將DNA稀釋，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)電泳圖譜、DNA含量及其A260/A280比值判斷不同提取方法的效果。

1.4 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR通用性檢測(cè)

將采用改進(jìn)方法提取的12種不同魚(yú)類DNA稀釋至50 ng/μL作為底物。14對(duì)蘭州鲇G-SSR引物來(lái)自魏大為等[18]公布的序列，21對(duì)EST-SSR引物由筆者所在實(shí)驗(yàn)室積累，引物序列見(jiàn)表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，模板DNA(50 ng/μL)2 μL，去離子水6 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，退火30 s，退火溫度依引物而定，72 ℃延伸 1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物在其他12種魚(yú)類中的擴(kuò)增情況，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算每對(duì)引物的有效擴(kuò)增率，以及G-SSR型和EST-SSR型微衛(wèi)星的平均有效擴(kuò)增率。

表2 21對(duì)蘭州鲇EST-SSR分子標(biāo)記引物序列

位點(diǎn)引物序列(5′—3′)退火溫度/℃JZ845705 F：TGTGCGAAAGGTGAAAGATTA R：AACTTGAATGGGAAGGAGGTG58JZ845090 F：CATAAAGTCTCCGTCAACC R：GTCATGGGAAATCAACAAT53JZ845784 F：ATCAATAAGCGTGGTGTCA R：GCTGTTTGCCTAACCTGA57JZ845762 F：TGTGAGTGATTGGTATGTGGT R：TTAATGCTGGGTCATGTAGAG59JZ845190 F：ACCTCCACTGAATCACAACA R：AAGACAGAAAAGAAAGAAACG56JZ845743 F：AGTGACTGCTAGTCCCAGAG R：GAGACGCAACATACAGAACC61JZ845100 F：ATCCCTGTATTTACCAGTCTCAC R：GCTTCACTTGGGTTCCTTTGT58JZ845703 F：CCAAATAGCGTGTAGTAGT R：CACTAAACTGTGAAGAAAGA55JZ845726 F：TATGAATGACCGTGGCAGAG R：CCAAGCGTAAGTTGAGGAA56JZ845789 F：ACGCAGACCAGACACCACC R：GCCAGCGGAGAAAGCAGT63JZ905272 F：GTAAGAGCGTCAGGGACTG R：GAATGTTGGTATGCTGGAAT62JZ905276 F：TCAAGCGTTCTGTGGGGTAT R：AAGTCGCATCCGTTCGTG59JZ905300 F：AGTATGTGAGTGCGAGA R：TAACGTAATGCAGGTAA53JZ905308 F：GGAAGTGATGTCGGTGTC R：CTGCTCGATGTAAAGAATGT59JZ905309 F：CCTGCTCCTTCCATCCTTT R：CGTTTACGCTCCGACTCTTAT59JZ905311 F：CCAGAATCCACCTTTGCCTAT R：GTCCTCCTGCTCCTTCCATC63JZ905314 F：TGACAGTGGAGGAGTATTGAGG R：ACAGGAAACCGAAGTGGAGT59JZ905328 F：TACATATTATGGCACTCGC R：AGATTGGTGAAACAGGCTA56JZ905334 F：CGCTCATTCCACATCCTT R：ACCACATCACCCAGTCCA61JZ905338 F：CAGGAAATGATGTGGGAGAA R：GAGACGAAGATGGGAAAGAGTA58JZ905348 F：TGTAAAGGCTGCGGTTCTC R：CCAATTTGTTGATGCTTAATGTA55

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

由圖1—3可見(jiàn)，酚-氯仿法和試劑盒法提取的DNA主條帶模糊，有拖尾現(xiàn)象，表明DNA含量較低，降解嚴(yán)重。與傳統(tǒng)的酚-氯仿法和試劑盒法相比，改進(jìn)方法提取的基因組DNA質(zhì)量較好，DNA主條帶清晰、明亮、整齊、無(wú)拖尾，DNA含量高，純度好，蛋白質(zhì)、RNA和雜質(zhì)污染少，且DNA降解程度低。

純凈的DNA樣品 A260/A280介于1.8～2.0，小于1.8表明有蛋白質(zhì)污染，大于2.0表明嚴(yán)重降解或含有大量RNA。由表3可以看出，傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒提取的DNA其A260/A280比值偏大，表明DNA降解比較嚴(yán)重，與電泳檢測(cè)結(jié)果一致。改進(jìn)方法提取的DNA其A260/A280比值介于1.78～1.91、接近1.8，表明提取的DNA純度較好。

M:DL15000 Marker；1—4:蘭州鲇基因組DNA; A:酚-氯仿法; B:試劑盒法

M:DL15000 Marker； 1—12:分別為蘭州鲇、大口鲇、小口鲇、胡子鲇、斑點(diǎn)叉尾鮰、黃桑、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鯽魚(yú)、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈的基因組DNA

M:DL15000 Marker； 1—20:蘭州鲇基因組DNA圖3 改進(jìn)方法提取的20尾蘭州鲇基因組DNA結(jié)果

表3 不同方法提取的魚(yú)類基因組DNA純度及濃度

方法A260/A280平均含量/(ng/μL)含量范圍/(ng/μL)酚-氯仿法2．02～2．14404．52±53．54349．4～468．8試劑盒法1．94～2．0689．67±13．4274．7～104．1改進(jìn)的方法1．78～1．91216．96±71．3289．7～353．5

2.2 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR通用性

2.2.1 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種魚(yú)類中的擴(kuò)增結(jié)果 由表4可以看出，14對(duì)G-SSR引物和21對(duì)EST-SSR引物均可在蘭州鲇個(gè)體中擴(kuò)增出特異性片段。蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚(yú)類中的通用率相近，EST-SSR在鯉形目魚(yú)類中的通用率明顯高于G-SSR；6個(gè)EST-SSR型位點(diǎn)JZ845705、JZ905272、JZ905276、Z905309、JZ905311、JZ905314在12種魚(yú)類中均可獲得特異性擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小基本一致，在G-SSR型位點(diǎn)中不曾發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。2種類型的微衛(wèi)星均表現(xiàn)出隨物種間遺傳距離的增加，其通用性下降(表5)。

表4 14個(gè)G-SSR和21個(gè)EST-SSR在12種魚(yú)類的擴(kuò)增結(jié)果

SSR類型位點(diǎn)核心序列有效擴(kuò)增率/%物種蘭州鲇大口鲇小口鲇革胡子鲇斑點(diǎn)叉尾鮰黃顙鯉魚(yú)草魚(yú)鯽魚(yú)白鰱花鰱大鼻吻鮈G-SSRKJ008491(AC)11?(TC)2325．00+++---------KJ008560(CT)14?(AC)1858．33+++--+-++--+KJ008535(AG)2850．00+++？-+-++---KJ008529(AG)28?(AC)1450．00++++？----+？+KJ008462(AG)31?(GT)3233．33+++--+------KJ008547(GA)1658．33+++？-+--+++？KJ008567(AG)1641．67++++？+？-----KJ008551(GA)2283．33++++？？++++++KJ008523(AC)3133．33+++--+-----？KJ008552(GA)22?(AG)32?(CA)3750．00+++--+-+？+--KJ008564(AC)2158．33++++？+-++--？KJ008548(GA)18?(AGAT)8?(AG)24?58．33+？+？-++++？+-(AGAT)7?(GA)29KJ008522(AC)29?(GA)2450．00++？？+--？-+++KJ008557(TC)20?(CT)1416．67++？---------EST-SSRJZ845705(AG)12?(GA)7100．00++++++++++++JZ845090(AC)12?(AC)1341．67+？-----+-+++JZ845784(TG)23?(GT)1825．00+++---------JZ845762(GT)13?(GA)1016．67++？---------JZ845190(CT)7?(TC)2558．33++++-++-？+--JZ845743(CT)2316．67++----？-----JZ845100(GCA)1433．33+++-+？------JZ845703(AC)16?(CT)2516．67++----------JZ845726(CAG)6?(AGC)741．67++-----++-？+JZ845789(TGC)18?(TGT)441．67+++-？----++-JZ905272(CA)40100．00++++++++++++JZ905276(GT)17100．00++++++++++++JZ905300(GT)2016．67++？---------JZ905308(AG)10?(GA)10?(AG)1225．00++？？+-------JZ905309(TC)11?(CA)8100．00++++++++++++JZ905311(GT)14?(AG)11100．00++++++++++++JZ905314(GA)13100．00++++++++++++JZ905328(CA)12?(AC)950．00+++？-？+？+？？+JZ905334(TG)1116．67++--？---？---JZ905338(CA)2591．67++？+++++++++JZ905348(TG)12?(TG)716．67++？---------

注：“+”表示有特異性擴(kuò)增條帶；“-”表示無(wú)特異性擴(kuò)增條帶；“?”表示非特異性擴(kuò)增或擴(kuò)增條帶很弱難以判斷。

表5 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚(yú)類和鯉形目魚(yú)類中的通用率 %

2.2.2 G-SSR和EST-SSR擴(kuò)增圖譜分析 根據(jù)蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種不同魚(yú)類的擴(kuò)增圖譜(圖4)發(fā)現(xiàn)，G-SSR比EST-SSR在不同物種間具有更高長(zhǎng)度變異性，如G-SSR型微衛(wèi)星位點(diǎn)KJ008547在白鰱和花鰱中的擴(kuò)增條帶明顯偏大。

M：DL2000 Marker； 1—12:分別為以蘭州鲇、大口鲇、小口鲇、革胡子鲇、斑點(diǎn)叉尾鮰、黃顙、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鯽魚(yú)、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈基因組DNA為底物的PCR產(chǎn)物圖4 部分蘭州鲇G-SSR(A)和EST-SSR(B)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

高質(zhì)量的DNA提取有4個(gè)關(guān)鍵：對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行有效破碎，使核蛋白釋放出來(lái)；核蛋白充分變性，釋放出DNA；使DNA酶失去活性，防止DNA被其酶解；盡量除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染。為此，在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量做到以上幾點(diǎn)以確保提取到高質(zhì)量的基因組DNA。傳統(tǒng)的酚-氯仿法是提取動(dòng)物基因組DNA最常用的方法，此方法為了最大限度除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)需多次抽提，每次抽提為了不吸到中間相雜質(zhì)，需留下較多的上清液，抽提次數(shù)越多，DNA的損失量就越大；此外吸取上清對(duì)試驗(yàn)操作者的技能要求較高，對(duì)初學(xué)者是一種挑戰(zhàn)；因整個(gè)試驗(yàn)流程較長(zhǎng)，出錯(cuò)的可能性較大，造成提取效果不穩(wěn)定。

本試驗(yàn)參考Turtinen等[19]和樂(lè)小亮等[5]的方法對(duì)傳統(tǒng)的酚-氯仿法進(jìn)行改進(jìn)，在組織消化完畢后，加入高濃度的NaAc，有利于DNA的充分溶解，蛋白質(zhì)變性析出。同時(shí)加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇混合物(25∶24∶1)對(duì)裂解液抽提1次，得到大量低純度的基因組DNA，然后用基于吸附材料的離心柱型DNA純化試劑盒對(duì)其純化，得到高純度的DNA。這種DNA提取方法減少了抽提次數(shù)，DNA的損失量大大減少，DNA得率較高，并且可最大限度地除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。改進(jìn)的方法中DNA純化步驟主要采用離心的方式進(jìn)行，便于批量化操作，且比傳統(tǒng)酚-氯仿法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少。與傳統(tǒng)的酚-氯仿法相比較，改進(jìn)方法成本有所提高，但提取效果卻明顯提高。與專業(yè)的DNA提取試劑盒相比較，成本大幅降低，并且提取效果優(yōu)于試劑盒。此外，改進(jìn)方法還具有需要樣品量小、穩(wěn)定性高、便于批量提取等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)于微衛(wèi)星的通用性在水生生物中的研究，前人已有報(bào)道[20-21]。本研究利用蘭州鲇14對(duì)G-SSR引物和21對(duì)EST-SSR引物對(duì)來(lái)自鲇形目和鯉形目的12種魚(yú)類進(jìn)行通用性分析，結(jié)果顯示：蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目、鯉形目魚(yú)類中的通用率分別為63.10%、32.14%和61.11%、44.44%，表明蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在近緣物種中有很高的通用性，但隨著親緣關(guān)系拉大，微衛(wèi)星的通用性隨之降低。

6個(gè)EST-SSR型位點(diǎn)JZ845705、JZ905272、JZ905276、Z905309、JZ905311、JZ905314在12種魚(yú)類中均可獲得特異性擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小基本一致，在G-SSR型位點(diǎn)中不曾發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。此外，根據(jù)二者的擴(kuò)增圖譜發(fā)現(xiàn)，G-SSR比EST-SSR在不同物種間具有更高長(zhǎng)度變異性，可見(jiàn)，基因組中編碼序列要比非編碼序列更為保守。本研究表明，蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚(yú)類中的通用率相近，但EST-SSR在鯉形目魚(yú)類中的通用率明顯高于G-SSR，這表明EST-SSR比G-SSR在物種間通用性好，這一結(jié)果與Liewlaksaneeyanawin等[22]和宿俊吉等[23]的報(bào)道結(jié)果一致。蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種魚(yú)類的通用率分別為47.62%和52.78%，具有較高的通用性，當(dāng)缺乏微衛(wèi)星標(biāo)記時(shí)，借用近緣物種的微衛(wèi)星是一種更為簡(jiǎn)單、快捷、廉價(jià)的方法[15]。

本研究利用酚-氯仿法結(jié)合DNA純化試劑盒提取魚(yú)類基因組DNA效果較好，具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間和成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合一些樣品珍貴、需批量提取的科學(xué)研究試驗(yàn)。此外，本研究利用蘭州鲇微衛(wèi)星對(duì)來(lái)自鲇形目和鯉形目的12種魚(yú)類進(jìn)行跨目通用性分析，結(jié)果顯示，隨著物種間親緣關(guān)系變大，其通用性逐漸降低，但部分微衛(wèi)星在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間仍具有很好的通用性。這些研究結(jié)果為微衛(wèi)星在跨目物種間的通用性研究及利用微衛(wèi)星開(kāi)展比較基因組學(xué)等方面的研究提供基礎(chǔ)資料。

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Transferability Analysis ofSiluruslanzhouensisG-SSR and EST-SSR Markers in Siluriformes and Cypriniformes Fishes

YANG Zhongli1,2,LIAN Zongqiang2,3,WU Xudong1,2,3*,YU Zhaoxi1,WANG Yan2,XIAO Wei2,3,SAI Qingyun2,3
(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Ningxia Fisheries Research Institute,Yinchuan 750001,China; 3.Ningxia Engineering Research Center for Fisheries,Yinchuan 750001,China)

In order to investigate the transferability ofSiluruslanzhouensisG-SSR and EST-SSR in Siluriformes and Cypriniformes,12 different fishes were used as research objectives to extract genomic DNA by using improved phenol-chloroform method,which combined with DNA purification kit,traditional phenol-chloroform method and DNA extraction kit,respectively.The genomic DNA was detected by agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometer.The results showed that the genomic DNA extracted by the improved phenol-chloroform method was obviously superior to the other two methods in purity and stability,and the electrophoresis bands were very clear,neat and bright.The method had the advantages of simple manipulating,short time-consuming,speediness and batch extraction.Furthermore,14 G-SSRs and 21 EST-SSRs ofSiluruslanzhouensiswere selected to analyze the transferability of 12 Siluriformes and Cypriniformes fishes.The results indicated that the transferable rates of 14 G-SSRs and 21 EST-SSRs in Siluriformes and Cypriniformes fishes were 63.10%,32.14% and 61.11%,44.44% respectively,revealing that the transferability decreased with the increase of genetic relationship among species.

genomic DNA;Siluruslanzhouensis; Siluriformes; Cypriniformes; G-SSR; EST-SSR; transferability

2015-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360633)；寧夏對(duì)外科技合作項(xiàng)目；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B09)

楊忠禮(1990-)，男，甘肅合水人，在讀碩士研究生，研究方向：淡水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生物學(xué)及增養(yǎng)殖。 E-mail:yang2009191048@163.com

*通訊作者：吳旭東(1967-)，男，寧夏銀川人，研究員，博士，主要從事水生動(dòng)物分子生物學(xué)及種質(zhì)資源保護(hù)與增養(yǎng)殖研究。E-mail:amy95@126.com

Q346+.5

A

1004-3268(2016)06-0130-07