耿元邦，董發(fā)明*，馬 霞，張國(guó)祖,3，劉永錄(.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 47003； .河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 45464)

蓮藍(lán)口服液的制備工藝研究

耿元邦1，董發(fā)明1*，馬 霞2，張國(guó)祖2,3，劉永錄2
(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 451464)

為了確定蓮藍(lán)口服液的生產(chǎn)工藝參數(shù)，為蓮藍(lán)口服液的生產(chǎn)提供參考，以(R，S)-告依春含量、穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為依據(jù)，采用水提、水提醇沉的方法提取板藍(lán)根和大青葉，醇提法提取穿心蓮，篩選出各成分含量均較高的蓮藍(lán)口服液制備工藝。結(jié)果顯示，穿心蓮粗粉加10倍量85%乙醇進(jìn)行滲漉提取，滲漉液中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量最高；板藍(lán)根和大青葉進(jìn)行水煎濃縮，濃縮液中加入穿心蓮滲漉液使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)進(jìn)行醇沉，穿心蓮、板藍(lán)根、大青葉三者的質(zhì)量比為1∶2∶1制備的蓮藍(lán)口服液各標(biāo)示成分含量最高。

穿心蓮； 板藍(lán)根； 大青葉； 提取

溫?zé)岵∮赏飧袦責(zé)岵⌒耙?，以熱象偏重為主要特征。該病具有季?jié)性，且有不同程度的傳染性，易在動(dòng)物群體中和群體間傳播蔓延，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失。臨床用于預(yù)防治療溫?zé)岵〉闹兴幏絼┯小吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》(第2部)和《中華人民共和國(guó)藥典》(第1部)中收錄的清解合劑、清溫?cái)《旧?、銀翹散、雙黃連口服液等[1-2]，但這些方劑成分多、制備和質(zhì)量控制程序繁瑣、藥材成本高，限制了其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的使用，如清解合劑由板藍(lán)根、連翹、黃芩、金銀花、玄參等12味中藥組成，其雙黃連口服液原料成本就在50～100元/kg。為此，本試驗(yàn)在《中華人民共和國(guó)獸藥典》(第2部)收載的方劑板青顆?；A(chǔ)上進(jìn)行加減化裁/重新組方。板藍(lán)根和大青葉均含有(R，S)-告依春、靛玉紅等成分[3]，有清熱解毒、涼血清咽的功效，一般采用水提或水提醇沉的方法進(jìn)行提取。穿心蓮的主要有效成分為二萜內(nèi)酯類，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)靜的藥效[4-5]，其中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量最高，但其在水中的溶解度非常小，故本研究對(duì)穿心蓮采用醇提工藝進(jìn)行研究，在保證提取率的前提下，簡(jiǎn)化操作步驟，以(R，S)-告依春、穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為依據(jù)，分別篩選板藍(lán)根、大青葉的最佳組成及提取工藝，優(yōu)化穿心蓮提取工藝[6-8]，最終確定蓮藍(lán)口服液的最佳組方及最佳生產(chǎn)工藝，為蓮藍(lán)口服液的生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

SHZ-D(Ⅲ)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；津騰溶劑過(guò)濾器，由天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀(P230Ⅱ)，由大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)；色譜柱：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm)；超聲波清洗器(KQ3200)，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；電子分析天平(AUW220D)，由日本島津公司生產(chǎn)。

板藍(lán)根、大青葉、穿心蓮全葉購(gòu)自禹州凱旋藥業(yè)有限公司，所有藥物經(jīng)鑒定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；95%乙醇、分析甲醇，由天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；一級(jí)色譜甲醇，由天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為111753-201304)、穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為110854-201313)、脫水穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為110797-200307)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為110717-200204)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 穿心蓮提取工藝的優(yōu)化

將穿心蓮粗粉碎后分別加不同體積倍數(shù)的乙醇進(jìn)行滲漉提取，以穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，分別設(shè)置加乙醇體積分?jǐn)?shù)(75%、85%、95%)、加醇量(5倍、10倍、15倍)及浸泡時(shí)間(12 h、24 h、36 h)進(jìn)行正交試驗(yàn)[9]，統(tǒng)計(jì)每個(gè)因素各個(gè)水平下的指標(biāo)總和K1、K2、K3，平均值k1、k2、k3以及極差R。分析各因素對(duì)穿心蓮提取的影響程度，以確定最佳提取條件。穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量采用高效液相色譜法檢測(cè)。

1.3 板藍(lán)根、大青葉提取工藝的優(yōu)化

參考藥典中板藍(lán)根顆粒、板青顆粒的制備工藝，以(R,S)-告依春含量為指標(biāo)，對(duì)板藍(lán)根、大青葉的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，即板藍(lán)根和大青葉分別采用水提和水提醇沉的工藝進(jìn)行提取[10-11]。

表1 三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 水提工藝 分別按照板藍(lán)根︰大青葉=2∶1、板藍(lán)根∶大青葉=1∶1、板藍(lán)根∶大青葉=1∶2的質(zhì)量比稱取適量原藥材，加10倍量水，浸泡30 min，煎煮2次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材。各樣品均分為2份，離心后備用。各樣品取其中1份分別標(biāo)記為樣品1、樣品2、樣品3。

1.3.2 水提醇沉工藝 分別取上述水提工藝中板藍(lán)根和大青葉水提液的另一份樣品，分別加乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為60%，4 ℃靜置24 h，棄去沉淀，過(guò)濾，濾液回收濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材，離心，分別標(biāo)記為樣品4、樣品5、樣品6。

采用高效液相色譜法檢測(cè)樣品1—6中(R,S)-告依春和靛玉紅含量[12]。

1.4 蓮藍(lán)口服液提取工藝的優(yōu)化

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根與大青葉質(zhì)量比為2∶1的水煎濃縮液中加入1份以上穿心蓮時(shí)，滲漉液醇沉回收后的樣品易出現(xiàn)，結(jié)晶現(xiàn)象，對(duì)結(jié)晶樣品離心檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)晶物為穿心蓮內(nèi)酯成分，故選擇板藍(lán)根2份、大青葉1份的水煎濃縮液中加入1份穿心蓮滲漉液進(jìn)行醇沉，即配方組成為板藍(lán)根︰大青葉︰穿心蓮為 2∶1∶1。

以穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量及(R,S)-告依春含量為考察指標(biāo)，采用穿心蓮滲漉液(乙醇體積分?jǐn)?shù)75%)對(duì)板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量比為2∶1的水煎液進(jìn)行醇沉，對(duì)醇沉?xí)r乙醇最終體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察。將同一批板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量比為2∶1的水煎濃縮液均分為12份(每份240 mL)，每3份為 1個(gè) 處理，處理1加入乙醇使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為60%，醇沉過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材，然后加入穿心蓮滲漉回收液(穿心蓮滲漉液回收乙醇至含藥量1 g/mL)。處理2—4中分別加入等量穿心蓮滲漉液(800 mL)，調(diào)節(jié)乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)依次為50%、60%、70%，醇沉過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材。優(yōu)選醇沉?xí)r乙醇的體積分?jǐn)?shù)，處理分組見(jiàn)表2。

表2 蓮藍(lán)口服液制備工藝處理分組

2 結(jié)果與分析

2.1 穿心蓮提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)表3極差大小可知，影響穿心蓮的提取因素主次順序?yàn)锳>B>C，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)>加醇量>浸泡時(shí)間，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、10倍加醇量時(shí)穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量最高，浸泡時(shí)間對(duì)提取影響較小。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)的可行性，選取最佳工藝為A2B2C1，即加10倍量85%乙醇、常溫浸泡12 h后滲漉。

表3 正交試驗(yàn)穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量結(jié)果

2.2 板藍(lán)根、大青葉提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

由表4可以看出，水提醇沉樣品(樣品4—6)中(R,S)-告依春和靛玉紅含量高于相應(yīng)組方比例的水提樣品(樣品1—3)。靛玉紅在水提或水提醇沉提取液中含量均很低，僅為0.13～0.23 μg/mL，但在水提醇沉樣品中的含量稍高于相應(yīng)的水提樣品中的含量；(R，S)-告依春在水提樣品1—3中含量較低，在醇沉后的樣品4—6中含量較高，樣品4中(R,S)-告依春含量高達(dá)140.6 μg/mL。故選擇樣品4的比例(板藍(lán)根︰大青葉=2∶1)進(jìn)行后續(xù)研究。

表4 不同提取工藝板藍(lán)根、大青葉樣品中各成分的含量 μg/mL

2.3 蓮藍(lán)口服液提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

按照1.4中的處理方法制得4批蓮藍(lán)口服液樣品，各標(biāo)示成分的含量見(jiàn)表5。處理1與處理3、4的穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量、(R,S)-告依春含量差異不顯著，但顯著高于處理2。處理1先用乙醇醇沉板藍(lán)根和大青葉的水煎濃縮液，再回收穿心蓮滲漉液中的乙醇，提取過(guò)程復(fù)雜并且用乙醇量多，增加了成本。處理4和處理3僅需回收1次乙醇，但處理4的乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為70%，比處理3用量大?？紤]到提取過(guò)程的簡(jiǎn)化及成本的節(jié)約，最終確定處理3為蓮藍(lán)口服液的提取工藝，即板藍(lán)根、大青葉(2∶1)的水煎濃縮液240 mL，加入穿心蓮滲漉液800 mL，調(diào)節(jié)乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為60%，醇沉過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收濃縮至每毫升相當(dāng)于1 g原藥材。

表5 不同醇沉濃度蓮藍(lán)口服液中各成分的含量

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

穿心蓮的提取工藝多選用乙醇溫浸或者滲漉提取[13]，但乙醇溫浸工藝耗時(shí)長(zhǎng)、用醇量大，因此，本試驗(yàn)選用滲漉提取方法，通過(guò)不同滲漉時(shí)間、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)和不同體積的乙醇進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取方法。最后確定穿心蓮的提取工藝為：10倍量85%乙醇進(jìn)行滲漉提取12 h。

將板藍(lán)根和大青葉的提取工藝進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)水提醇沉工藝的標(biāo)示成分含量明顯比直接水提的含量高，且以板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量比為2∶1的樣品中含量最高。因此，板藍(lán)根和大青葉的提取工藝定為板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量比為2∶1，加10倍量水煎煮2次，濃縮，再進(jìn)行醇沉。

結(jié)合穿心蓮及板藍(lán)根和大青葉提取工藝的初步研究，按簡(jiǎn)化操作步驟、節(jié)約成本的原則，將板藍(lán)根、大青葉質(zhì)量比2∶1水煎醇沉回收乙醇后與穿心蓮滲漉回收液(含藥量1 g/mL)混合，以及采用穿心蓮滲漉液(醇體積分?jǐn)?shù)75%)對(duì)板藍(lán)根、大青葉(2∶1)水煎液進(jìn)行醇沉，對(duì)醇沉?xí)r乙醇最終體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%)進(jìn)行了考察，對(duì)蓮藍(lán)口服液提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，穿心蓮與板藍(lán)根及大青葉分別提取再混合的工藝與采用穿心蓮滲漉液對(duì)板藍(lán)根、大青葉(質(zhì)量比2∶1)水煎液進(jìn)行醇沉(乙醇最終體積分?jǐn)?shù)60%和70%)處理間差異不顯著。最終將蓮藍(lán)口服液的最佳提取工藝確定為：穿心蓮粗粉加10倍量85%乙醇浸泡12 h后滲漉，得滲漉液；板藍(lán)根和大青葉以質(zhì)量比2∶1進(jìn)行水煎濃縮，濃縮液中加入穿心蓮滲漉液使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為60%進(jìn)行醇沉，回收乙醇調(diào)節(jié)至每1 mL相當(dāng)于1 g原藥材，制備蓮藍(lán)口服液。

穿心蓮、板藍(lán)根、大青葉三者的質(zhì)量比為1∶2∶1，并將穿心蓮滲漉液用作板藍(lán)根和大青葉水提液的醇沉溶液，制得的蓮藍(lán)口服液各標(biāo)示成分含量較高。用穿心蓮的含醇滲漉液對(duì)板藍(lán)根和大青葉提取液進(jìn)行醇沉，不僅節(jié)省乙醇的使用量，而且減少乙醇的回收次數(shù)，簡(jiǎn)化了提取工藝，降低了生產(chǎn)成本，更利于臨床的推廣應(yīng)用。

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Study on Preparation Technology of Andrographis-isatidis Oral Liquid

GENG Yuanbang1,DONG Faming1*,MA Xia2,ZHANG Guozu2,3,LIU Yonglu2
(1.College of Animal Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China;3.Henan Kangxing Pharmaceutical Company Limited,Zhengzhou 451464,China)

In order to optimize extraction process of andrographis-isatidis oral liquid and provide a reference for industrial production of this preparation,the research had been screened out the best abstraction technological conditions of andrographis-isatidis oral liquid by water extraction,water extraction and ethanol precipitation,with the content of R-S epigoitrin,andrographolide and dehydroandrographolide as the indexes.The results showed that the contents of andrographolide and dehydroandrographolide were the hightest,when the extraction condition wasAndrographispaniculatawith 10 times amount of 85% ethanol.Concentration liquid was obtained by the methods of decoction and concentration ofIsatistinctoriaandIsatisindigotica，percolation liquid were added to the concentration liquid for alcohol precipitation with the alcohol concentration of 60%.The active ingredient of andrographis-isatidis oral liquid peaked when the mass ratio ofAndrographispaniculata,IsatistinctoriaandIsatisindigoticawas 1∶2∶1.

Andrographispaniculata;Isatistinctoria;Isatisindigotica; extraction

2015-12-20

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目( 122102110185)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HUAHE2015009)

耿元邦(1990-)，男，河南禹州人，在讀碩士研究生，研究方向：中獸藥新制劑研發(fā)。E-mail：348856323@qq.com

*通訊作者：董發(fā)明(1964-)，男，河南武陟人，教授，博士，主要從事中獸醫(yī)與中獸藥研究。E-mail：dfming24@aliyun.com

S859.3

A

1004-3268(2016)06-0126-04