劉書偉，王 燕，都二霞，胡勁召

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022； 2.海南熱帶海洋學(xué)院熱帶生態(tài)環(huán)境保護學(xué)院，海南 三亞 572022； 3.美國康涅狄格大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，康涅狄格州 法明頓 06032)

石灰、蔞葉處理檳榔對小鼠生殖毒性及體溫的影響

劉書偉1，王 燕2*，都二霞3，胡勁召2

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022； 2.海南熱帶海洋學(xué)院熱帶生態(tài)環(huán)境保護學(xué)院，海南 三亞 572022； 3.美國康涅狄格大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，康涅狄格州 法明頓 06032)

為探索添加蔞葉和石灰對檳榔毒副作用的影響，設(shè)置蔞葉+檳榔、石灰+檳榔、蔞葉+石灰+檳榔、檳榔4個處理及空白對照(蒸餾水)，分別將不同處理的水提液(蒸餾水)對SPF級KM小鼠進行灌胃處理，每天1次，連續(xù)灌胃14 d，測定小鼠的生精細胞凋亡指數(shù)、Bcl-2與Bax蛋白表達量及體溫。結(jié)果表明，與空白對照相比，各處理的睪丸曲細精管中生精細胞凋亡指數(shù)均增高且差異顯著，其中檳榔處理的凋亡指數(shù)最大，其次是檳榔+石灰，檳榔+蔞葉+石灰處理最小，檳榔處理的凋亡指數(shù)是檳榔+蔞葉+石灰處理的2.6倍；各處理的Bax蛋白表達陽性率均增高，Bcl-2蛋白表達陽性率均降低，其中檳榔處理變化幅度最大，檳榔+蔞葉+石灰檳榔處理最小，檳榔+蔞葉+石灰處理的Bcl-2/Bax值是檳榔處理的1.41倍；各處理的小鼠體溫均呈現(xiàn)下降趨勢，檳榔+蔞葉+石灰處理體溫相對最高且降幅最小，與檳榔處理相反?？梢?，添加蔞葉或石灰能減弱檳榔對小鼠的毒性作用。

檳榔鮮果； 小鼠； 細胞凋亡； 體溫

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科檳榔屬的熱帶常綠喬木，其果實因具有重要的藥用價值而位居中國四大南藥之首[1]。檳榔是許多中藥復(fù)方的組成成分，如四磨湯、檳榔四消丸、柴胡舒肝丸等，其應(yīng)用較廣泛。在獸醫(yī)臨床上，檳榔主要用于治療絳蟲、蛔蟲、鉤蟲等[2-4]，也可治療牲畜的食積氣滯、腹痛脹滿便秘、增加食欲等[5-7]，還可用于抗氧化、抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛等[8]。2003年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(IARC)認定檳榔為Ⅰ級致癌物[9]。此后，檳榔的使用安全性越來越受到質(zhì)疑，國內(nèi)外學(xué)者對檳榔進行了較多研究，但之前的研究主要集中在檳榔生物堿的藥理及毒性方面，而對檳榔鮮果添加物的研究較少[10-12]。關(guān)于檳榔毒性來源一直存在爭議，檳榔咀嚼地區(qū)一般把毒性來源歸結(jié)于添加物上，但缺乏科學(xué)依據(jù)。為此，針對檳榔常用添加物進行毒性評價，采用鮮果檳榔傳統(tǒng)食用的方法對小鼠進行灌胃，研究小鼠對毒物較敏感的生殖器官的毒性變化情況，以小鼠睪丸曲細精管中的生精細胞凋亡狀況來評價檳榔對小鼠的生殖毒性，并觀察小鼠染毒后體溫的變化，評價檳榔添加物對其毒副作用的影響，旨在為檳榔在獸藥學(xué)領(lǐng)域的進一步產(chǎn)品開發(fā)和利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 供試動物

4周齡SPF級KM小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2013—0004。購入后置于海南省三亞市功能檳榔重點實驗室動物房養(yǎng)殖，以江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司生產(chǎn)的SPF級小鼠專用維持飼料喂養(yǎng)，采取自由采食、飲水的喂養(yǎng)方式，適應(yīng)7 d后，選取表現(xiàn)無異常、大小均勻的小鼠待用，體質(zhì)量為(18±1)g。實驗室室內(nèi)溫度(22±3)℃，光照為12 h/d，相對濕度60%～70%。

1.2 試驗設(shè)計

按照食品毒理學(xué)實驗室操作規(guī)范(中華人民共和國國家標準GB15193—2014)進行試驗，選取45只4周齡、SPF級、大小均勻的健康KM雄鼠，隨機分為5個處理，即檳榔+蔞葉+石灰處理、檳榔+蔞葉處理、檳榔+石灰處理、檳榔處理及空白對照處理(CK，蒸餾水)。每個處理9只雄鼠。采用4個處理的水提液和蒸餾水對小鼠經(jīng)口灌胃。具體要求為：小鼠禁食8 h后稱其體質(zhì)量后對小鼠灌胃，每天1次，灌胃劑量標準為15 mL/kg，給藥后禁食禁水1 h后，自由采食飲水，連續(xù)灌胃14 d，小鼠均為單只單籠飼養(yǎng)。

1.3 檳榔材料及制備

檳榔鮮果采摘于海南三亞吉陽區(qū)的檳榔種植園，采收的檳榔莖部帶宿萼，切開后有未成熟的種子，外形橢圓、勻稱，縱向直徑為5～6 cm，橫向直徑為3～4 cm，光澤好、綠色純正。為防止檳榔水分揮發(fā)，檳榔采用保鮮膜包裹，冷藏待用。將鮮果檳榔清洗干凈后晾干，切碎待用。用馬弗爐燒制貝殼，制備貝殼粉，然后把貝殼粉與蒸餾水混合制備成黏稠狀石灰待用。取碎檳榔、新鮮蔞葉和黏稠狀石灰按照質(zhì)量比144∶16∶9混合，取碎檳榔與新鮮蔞葉按照質(zhì)量比9∶1混合，取碎檳榔與黏稠狀石灰按照質(zhì)量比16∶1混合。分別取各混合物500 g，并在各混合物中加入等質(zhì)量的蒸餾水，分別用研磨機粉碎研磨5 min，靜置水提4 h，然后用雙層紗布過濾，將濾液分別置于經(jīng)消毒后的離心管中，5 000 r/min離心10 min，然后采用0.22 μm除菌過濾膜過濾，濾液即為供試水提液，水提液現(xiàn)用現(xiàn)制，2 h內(nèi)處理完畢。

1.4 測定指標

1.4.1 生精細胞凋亡檢測 灌胃處理14 d后，脫頸椎處死小鼠，迅速摘取小鼠雙側(cè)睪丸，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)檢測。將睪丸組織切片置于熒光顯微鏡下觀察，細胞核中具有棕黃色顆粒且背景清晰的細胞視為陽性細胞，每張切片均選20個視野，計總的生精細胞凋亡數(shù)，通過計算得出生精細胞凋亡指數(shù)。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測睪丸組織Bax和Bcl-2蛋白的表達 參照姜卓等[13]的方法進行檢測。10%中性甲醛固定睪丸組織，鉻明礬處理組織切片，然后進行石蠟包埋、切片、展片、烘片、脫蠟等處理，采用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒按說明書進行操作，應(yīng)用JD-801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。

1.4.3 體溫 試驗期間，應(yīng)用北京海創(chuàng)高科科技有限公司生產(chǎn)的TH-212生物體溫計，從第2天開始對小鼠的體溫進行測量，每2 d測定1次，共計測量7次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

差異性統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，單因素ANOVA分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響

從圖1可知，與CK相比，其他4個處理的小鼠睪丸曲細精管中的生精細胞凋亡指數(shù)均有不同程度的增高；CK與檳榔+蔞葉、檳榔+石灰及檳榔處理差異極顯著，與檳榔+蔞葉+石灰處理差異顯著。與檳榔處理相比，添加蔞葉的2個處理生精細胞凋亡指數(shù)均極顯著降低，說明添加蔞葉后能降低檳榔對小鼠生殖器官的損傷。檳榔+蔞葉+石灰處理細胞凋亡指數(shù)值最小，檳榔處理細胞凋亡指數(shù)是其2.6倍，說明通過向檳榔里添加蔞葉和石灰，能減少檳榔對小鼠的生精細胞的傷害。

不同小、大寫字母表示在0.05、0.01水平差異顯著

2.2 不同處理對小鼠生精細胞的Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Bcl-2和Bax蛋白均參與生精細胞凋亡[14-15]。Bcl-2和Bax蛋白在功能上相互對立，Bcl-2蛋白抗細胞凋亡，Bax蛋白促細胞凋亡，Bcl-2/Bax值的大小是決定細胞是否發(fā)生凋亡的重要指標。從表1可看出，Bcl-2和Bax蛋白在各處理中均有不同程度的表達。在Bax蛋白表達陽性率方面，檳榔處理最大，且與CK差異顯著；其他3個處理略高于CK，但差異均不顯著。在Bcl-2蛋白表達陽性率方面，4個具有檳榔成分的處理均小于CK，其中CK與檳榔處理差異極顯著，與檳榔+石灰處理差異顯著，與其他2個處理差異不顯著；檳榔處理與檳榔+蔞葉+石灰處理差異極顯著。在Bcl-2/Bax方面，4個具有檳榔成分的處理均小于CK；檳榔+蔞葉+石灰處理、檳榔+蔞葉處理、檳榔+石灰和CK的Bcl-2/Bax值分別是檳榔處理的1.41倍、1.29倍、1.19倍和1.73倍。從以上分析可知，在誘導(dǎo)小鼠睪丸生精細胞凋亡方面，與檳榔處理相比，檳榔+蔞葉+石灰處理能降低凋亡基因蛋白Bax的表達，顯著地增強抗凋亡基因蛋白Bcl-2的表達，使Bcl-2/Bax值增大。說明添加蔞葉和石灰能明顯減弱檳榔對小鼠睪丸組織的傷害。

表1 不同處理的小鼠睪丸組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax差異性

注：同列數(shù)據(jù)不同小、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平差異顯著。

2.3 不同處理對小鼠體溫的影響

從圖2可以看出，整個試驗期間，檳榔+蔞葉+石灰處理、檳榔+蔞葉處理、檳榔+石灰處理、檳榔處理的小鼠體溫均低于CK；隨著灌胃天數(shù)的增加，4個具有檳榔成分的處理體溫均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，其中檳榔處理組小鼠體溫降低最為明顯。檳榔+蔞葉+石灰處理體溫降低幅度較小，且體溫均高于檳榔+蔞葉處理、檳榔+石灰處理和檳榔處理。

圖2 不同處理對小鼠體溫的影響

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：(1)檳榔水提液可誘導(dǎo)小鼠生精細胞凋亡，檳榔+蔞葉+石灰處理、檳榔+蔞葉處理、檳榔+石灰處理、檳榔處理的小鼠生精細胞凋亡指數(shù)增高，與CK差異均顯著。其中，檳榔處理凋亡指數(shù)是檳榔+蔞葉+石灰處理凋亡指數(shù)的2.6倍。此外，檳榔處理Bax蛋白表達陽性率最大，且與CK差異顯著，其他3個處理略高于CK，但差異不顯著；4個具有檳榔成分的處理的Bcl-2蛋白表達陽性率均小于CK，其中CK與檳榔處理差異極顯著，與檳榔+蔞葉+石灰處理差異不顯著，同時檳榔處理與檳榔+蔞葉+石灰處理差異極顯著。說明添加蔞葉和石灰，能減小檳榔對小鼠的傷害，不添加蔞葉或石灰的檳榔使小鼠生精細胞凋亡指數(shù)較大，使生精過程發(fā)生障礙，從而影響其生殖功能，其詳細機制還有待進一步探討。(2)4個具有檳榔成分的處理的小鼠體溫均不同程度低于CK，并均呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是小鼠基礎(chǔ)代謝率降低，各器官功能減弱，或者是各處理通過抑制小鼠下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，而使體溫調(diào)節(jié)功能下降。

胡怡秀等[16]曾報道，當檳榔堿水提液超過一定劑量時，會能使小鼠精子數(shù)量顯著減少、精子活動率明顯降低及精子畸形率明顯升高，甚至?xí)?dǎo)致小鼠性功能減低。高文平等[17]研究表明，檳榔堿能降低正常男性體外精子運動能力，其毒性與濃度時間成正比。劉書偉等[18]也表明，檳榔水提液影響小鼠體質(zhì)量、存活率及生精細胞凋亡指數(shù)，并與檳榔堿含量呈正相關(guān)。以上研究與本研究的結(jié)果總體一致，說明檳榔果中高劑量的檳榔堿對雄性小鼠的生殖系統(tǒng)可能造成一定的危害，但有待進一步的試驗研究。同時本研究發(fā)現(xiàn)，向檳榔里添加蔞葉和石灰，能減弱檳榔的毒副作用。但若把檳榔添加到飼料中時，同時加入蔞葉或石灰是否對牲畜具有積極影響，需進一步研究。

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Influence of Lime,PiperbetleProcessing Betelnut on Mice’ Genital Toxicity and Body Temperature

LIU Shuwei1,WANG Yan2*,DU Erxia3,HU Jinzhao2

(1.College of Tropical Biology and Agronomy,Hainan Tropical Ocean University,Sanya 572022,China; 2.College of Tropical Ecological Environmental Protection,Hainan Tropical Ocean University,Sanya 572022，China; 3.Department of Medicine,UConn Health,Farmington,CT 06032,USA)

To explore the toxic effects of betelnut afterPiperbetleand lime were added,the KM mice of SPF were intragastricly administered with water extract solution fromPiperbetle+betelnut,lime+betelnut,Piperbetle+lime+betelnut and betelnut once a day and observed for 14 d.Spermatogenic cell index,Bcl-2,Bax and body temperature of mice were measured.The results showed that spermatogenic cell apoptosis index of treatments were increased and had a significant difference with the control,in which the betelnut treatment was the biggest and was 2.6 times ofPiperbetle+lime+betelnut treatment that was the smallest,and lime+betelnut was between them.The positive expression level of Bax protein of the treatments were up regulated,but Bcl-2 protein was down regulated significantly,which betelnut treatment changed was the biggest,andPiperbetle+lime+betelnut was minimum,but the Bcl-2/Bax of the later was 1.41 times of the former.Body temperature of mice in four treatments were lower than CK and showed a trend of decline,Piperbetle+lime+betelnut treatment’s temperature was relatively higher and the smallest decrease,in contrast with betelnut.In short,addingPiperbetleor lime to betelnut could weaken genital toxicity in mice.

betelnut; mice; cell apoptosis; body temperature

2016-04-02

海南省中藥現(xiàn)代化專項項目(ZY201417)；三亞市院地科技合作項目(2014YD16，2015YD29)；三亞市功能檳榔研究重點實驗室項目(L1411)

劉書偉(1978-)，男，河南平輿人，副教授，碩士，主要從事中藥毒理、農(nóng)產(chǎn)品加工研究及相關(guān)教學(xué)工作。 E-mail:hnlsw@163.com

*通訊作者：王 燕(1979-)，女，河南太康人，副教授，碩士，主要從事檳榔研究及相關(guān)教學(xué)工作。 E-mail:wysw119@163.com

S859.3

A

1004-3268(2016)10-0151-04