原靜云，李小軍，任翠翠，原連莊

(1.河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

?

基于SSR標記的49個大白菜自交系遺傳多樣性分析

原靜云1，2，李小軍2，任翠翠2，原連莊1*

(1.河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

利用擴增條帶清晰且覆蓋白菜10個連鎖群的33個SSR標記分析了49個大白菜自交系的遺傳多樣性。結果表明，22對引物在供試材料間表現(xiàn)多態(tài)，11對引物表現(xiàn)單態(tài)擴增，多態(tài)引物頻率達到66.7%，其中A1、A3、A8和A9連鎖群上多態(tài)引物比例相對較高。多態(tài)引物共擴增出68個等位變異，每個位點2～8個，平均3.09個；不同引物的多態(tài)性信息含量0.05～0.88，平均0.48；品種間的遺傳距離變異為0～0.93，所有成對遺傳距離的平均值為0.51，UPGMA聚類結果與品種間親緣關系及其農藝特征有較好的一致性。

遺傳多樣性; 大白菜; SSR

大白菜起源于我國，在我國蔬菜栽培中屬于第一大類蔬菜，深受消費者喜歡。它屬于異花授粉作物，天然異交率高極易產生新的變種；同時由于我國地域廣闊、氣候各異，不同地區(qū)間又形成了許多各具特色的品種資源；再加上國內外廣泛的引種和雜交選育形成了許多新的白菜品種。最終形成了我國白菜資源豐富、遺傳背景相對復雜的現(xiàn)狀，這也為大白菜種質資源整理、分類及育種工作帶來了一定困難。因此，分析評價國內主要白菜種質資源或自交系的親緣關系是遺傳研究的一項重要內容。

SSR(simple sequence repeats)標記分布于植物整個基因組，具有多態(tài)性高、共顯性遺傳和易于分析等特點，已在白菜等作物的遺傳研究中逐步應用[1]。秦艷梅等[2]利用SSR標記分析了在我國廣泛種植的78份蔬菜用不結球白菜品種的遺傳關系，發(fā)現(xiàn)這些不結球白菜內部存在著明顯的群體結構。楊旭等[3]應用SSR等標記構建了包含326個標記位點的白菜遺傳圖譜，分別定位了5個和15個控制葉片數(shù)和單株質量的QTL。本研究選用白菜10個連鎖群上的SSR標記，分析49個大白菜自交系的遺傳關系，為大白菜種質資源保存及親本選配提供依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料包括49份大白菜材料，均是新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院大白菜育種中利用的重要自交系或不育系(表1)。

表1 供試大白菜自交系

1.2 方法

1.2.1 SSR引物選擇及分子標記分析 選取分布于蕓薹屬A 基因組10 個連鎖群上的50對SSR引

物，所有引物序列從文獻[4-5]獲得，由北京賽百盛生物技術有限公司合成。

所有材料在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待長出2片嫩葉后采用CTAB法提取DNA[6]。PCR反應體積為20 μL，含1×buffer(0.01 mol/L Tris-HCl，pH值8.3，0.05 mol/L KCl)、0.001 5 mol/L MgCl2、0.2 mol/L dNTPs、0.1 μLTaq酶(5 U/μL)、50 ng引物和60 ng模板DNA。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延長10 min。擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，硝酸銀染色。

首先從49份材料中選擇3份材料(晉毛可育、陜5555和C皇)對50對SSR引物進行篩選，選擇擴增條帶清晰且覆蓋白菜10個連鎖群的引物。采用33對引物對所有材料進一步檢測，每個連鎖群上的SSR標記數(shù)目1～5個。SSR擴增帶型在相同遷移率位置上有帶記為1，無帶記為0，建立0、1數(shù)據庫。

2 結果與分析

2.1 大白菜自交系的SSR多態(tài)性分析結果

在33對SSR引物中(表2)，22對在49個供試材料間表現(xiàn)多態(tài)，11對引物(CB10471、NI2-C12、Na12-E03、MR036、BRAS063、BRAS072、BRAS014、CB10278、OI10-F09、OI12-E03和MR156)表現(xiàn)單態(tài)擴增，多態(tài)引物頻率達到66.7%。多態(tài)性引物在白菜10個連鎖群的分布也存在一定差異(表3)，其中A1、A3、A8和A9連鎖群上所檢測的引物均表現(xiàn)多態(tài)擴增。圖1為引物BRAS078在供試材料中的電泳圖譜。

表2 SSR引物及其檢測到的等位變異數(shù)和PIC

續(xù)表2 SSR引物及其檢測到的等位變異數(shù)和PIC

多態(tài)引物共擴增出68個等位變異，每對引物位點2～8個，平均3.09個，其中有7對引物(Na10-C03、BRAS029、Na14-E02、CB10080、CB10143、Ra2-G08和Na10-B11)擴增的等位變異數(shù)達到4個及以上。A2連鎖群上的CB10471和NI2-C12在所有材料中只擴增出1個等位變異，且這2對引物分別在3份、5份材料中存在等位變異缺失，A3連鎖群上的引物Na14-E02擴增的等位變異數(shù)最多。A3、A5、A7、A8和A9連鎖群上平均每對多態(tài)引物擴增的等位變異大于或等于3.00個。22對多態(tài)引物間的PIC變異范圍為0.05～0.88，平均為0.48。

表3 10個白菜連鎖群的SSR多態(tài)性

連鎖群引物數(shù)/對多態(tài)引物數(shù)/對(占比/%)等位變異數(shù)/個每對多態(tài)引物的等位變異數(shù)/個A144(100)102．50A241(25)22．00A344(100)164．00A421(50)22．00A531(33．3)66．00A654(80)102．50A752(40)63．00A811(100)33．00A933(100)113．67A1021(50)22．00

材料編號同表1

2.2 大白菜自交系的遺傳距離分析結果

從品種兩兩之間的遺傳距離來看，遺傳距離變異為0～0.93，所有成對遺傳距離的平均值為0.51。其中J來不育和J來可育之間與D17和J開之間的遺傳距離都為0，J來不育和F78之間的遺傳距離最大，達到0.93。

2.3 大白菜自交系的聚類分析結果

UPGMA聚類結果與品種間親緣關系或其農藝特征有較好的一致性(圖2)。以遺傳距離系數(shù)0.48為基準，將49份材料劃分為6個類群。第Ⅰ類群有9個自交系，其中J來不育和J來可育、晉毛不育和晉毛可育、A夏黃和宜黃分別聚在一起，它們在表型上只有育性或花色存在差異，同時這個類群包括了高樁、合抱和疊抱3個類型。第Ⅱ類群有7個自交系，其中安包與Q2黃聚在一起，2個自交系在外形上相對一致，具有晚熟、大球、疊抱特征；其他品種都具有早熟、小球、葉片較厚且無毛特征。第Ⅲ類有8個自交系，除1304是一個早熟、有毛、輕疊抱自交系外，其他主要是合抱類型自交系。第Ⅳ類有6個自交系，多屬于無毛類型自交系。第Ⅴ類有12個自交系，J開和D17聚在一起，其外觀特征也完全一致，可能是異名同源自交系；雜淺與雜小聚在一起，雜小在外形上是雜淺的縮小版，是從雜淺中選出的突變體；其中除J80、J75、J細脈3個自交系是麻葉類型之外，其他自交系都屬于中熟疊抱自交系。第Ⅵ類有7個自交系，主要是高樁類型，只有56-3是早熟疊抱類型。

3 結論與討論

形態(tài)標記是白菜種質資源研究的傳統(tǒng)方法，但田間鑒定的表型性狀數(shù)量偏少，遺傳表達易受環(huán)境影響。20世紀90年代以來，分子標記技術逐漸成為植物基因組研究的重要手段。與田間種植鑒定相比，DNA分子技術具有高效、準確、受環(huán)境條件影響小、試驗操作簡單和周期短等優(yōu)點。目前SSR是白菜種質資源研究中應用最為廣泛的分子標記之一，非常適合材料間的遺傳關系評價。楊華等[8]利用SSR標記和農藝性狀分析了上海地區(qū)17份甘藍和44份白菜的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)的甘藍類蔬菜遺傳多樣性比較豐富，而白菜類蔬菜的遺傳基礎比較單一，現(xiàn)有的白菜型蔬菜種質資源急需保護，以防遺傳流失。高玉梅等[9]利用SSR標記分析了64份白菜類品種的遺傳結構。秦艷梅等[2]利用篩選出的21對多態(tài)性SSR引物在78 份白菜品種中擴增出56個等位變異，平均每個SSR標記產生2.7個等位變異，與本研究中每對多態(tài)引物擴增出的等位變異數(shù)(3.09個)相近。本研究基于SSR標記聚類結果較好地反映了大多數(shù)大白菜自交系的親緣關系并與主要農藝性狀特征有較好的一致性，進一步表明分子標記技術是植物基因組研究的重要手段,但形態(tài)性狀和分子標記相結合比單獨應用其中的一種可能更加有效。聚類分析也發(fā)現(xiàn)，個別親緣關系相近的材料(如J75和J75淺)分布于不同的類群中，說明這些材料間具有廣泛的遺傳變異性。本研究可以使育種者清楚地了解到這些種質資源的遺傳關系，為品種改良過程中對雜交親本的高效利用提供理論依據；同時還可以了解不育系的轉育進程，為大白菜不育系在生產上的大面積推廣應用提供科學保障。

圖2 供試大白菜基于UPGMA的聚類結果

[1] 李麗,鄭曉鷹.用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復合標記的建立[J].園藝學報,2009,36 (11):1627-1634.

[2] 秦艷梅,李向,趙建軍,等.不結球白菜品種基于SSR標記的群體結構分析[J].華北農學報,2013,28(3):62-66.

[3] 楊旭,余陽俊,張鳳蘭,等.應用DH群體進行白菜葉片數(shù)和單株重的QTL定位與分析[J].分子植物育種,2008,6(6):1213-1218.

[4] Piquemal J,Cinquin E,Couton F,etal.Construction of an oilseed rape(BrassicanapusL.) genetic map with SSR markers[J]. Theor Appl Genet,2005,111:1514-1523.

[5] Lowe A J,Moule C,Trick M,etal.Efficient large-scale development of microsatellites for marker and mapping applications inBrassicacrop species[J].Theor Appl Genet,2004,108:1103-1112.

[6] Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research,1980,8:4321-4325.

[7] Powell W,Morgante M,Andre C,etal.The comparison of RFLP,RAPD,AFLP and SSR(microsatellite) markers for germplasm analysis[J].Mol Breed,1996,2:225-238.

[8] 楊華,劉灶長,陳海榮,等.上海地區(qū)蕓薹屬蔬菜遺傳多樣性研究[J].植物遺傳資源學報,2006,7(3):264-269.

[9] 高玉梅,張淑江,章時蕃,等.白菜類作物資源群體結構分析[J].中國農學通報,2009,25(21):332-334.

Genetic Diversity Analysis of Forty-nine Chinese Cabbage Varieties Using SSR Markers

YUAN Jingyun1,2,LI Xiaojun2,REN Cuicui2,YUAN Lianzhuang1*

(1.Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province,Xinxiang 453003,China; 2.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Genetic diversity of forty-nine Chinese cabbage varieties was evaluated using 33 SSR markers distributed across the whole genome.Twenty-two(66.7%) of 33 SSR markers were polymorphic across all the genotypes,and the remaining amplified identical fragments in size,respectively.The frequencies of polymorphic markers on linkage groups A1,A3,A8 and A9 were higher than others.The polymorphic markers amplified 68 alleles with a mean of 3.09 alleles per locus,which varied from 2 to 8 among polymorphic locus.The values of polymorphism information content varied from 0.05 to 0.88 with an average of 0.48.The genetic distances between genotypes ranged from 0 to 0.93 with a mean of 0.51.Cluster analysis by UPGMA accorded with the genetic relationship and agronomic characteristics of these Cabbage varieties.

genetic diversity; Chinese cabbage; SSR

2016-06-20

河南省大宗蔬菜產業(yè)技術體系建設專項資金項目(S2010-03-06)；新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新人才項目(RC15001)

原靜云(1985-)，男，河南沁陽人，實習研究員，碩士，主要從事大白菜新品種選育及推廣工作。 E-mail:yuanjy886@163.com

*通訊作者：原連莊(1961-)，女，河南沁陽人，研究員，本科，主要從事大白菜新品種選育及栽培研究工作。 E-mail:yuanlianzhuang@163.com

S634

A

1004-3268(2016)11-0092-04