白艷麗　金建軍　劉獻(xiàn)民　田笑笑

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血漿游離DNA定量檢測(cè)在胃癌診斷中的價(jià)值

白艷麗金建軍劉獻(xiàn)民田笑笑

【摘要】目的 探討血漿游離DNA定量檢測(cè)在胃癌診斷中的價(jià)值。方法 收集33例胃癌患者、44例健康對(duì)照者血液標(biāo)本，血漿微量DNA抽提試劑盒提取血漿游離DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血漿游離DNA含量，評(píng)價(jià)血漿游離DNA水平在胃癌的診斷中的價(jià)值。結(jié)果 胃癌組血漿游離DNA水平高于對(duì)照組（P＜0．001）；胃癌敏感性和特異度分別72．7%和93．2%，ROC曲線下面積為0．902。TNM Ⅲ期患者血漿游離DNA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者（P＜0．05）。結(jié)論 血漿游離DNA定量檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷具有一定的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】胃癌；血漿游離DNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；診斷

Objective To explore the cell-free DNA in the plasma of patients withgastric cancer and evaluate its diagnostic value． Methods The plasma cellfree DNA of 33 patients with gastric cancer and 44 controls were extracted and purified by TIANamp Macro DNA Kit． Quantitation of plasma DNA was performed by realtime fluores-cence quantitative PCR． ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of plasm cell-free DNA for gastric cancer．Results The level of plasma cell-free DNA of patients was significantly higher than that of the controls． In addition，plasma cell-free DNA level was associated with TNM stage（P＜0．05）． Conclusion Quantification of plasma cell-free DNA may be a valuable tool in the diagnostics of gastric cancer．【Key words】 Gastric cancer，Plasma cell-free DNA，RT-qPCR，Diagnosis

近年流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，胃癌發(fā)病率居全國(guó)各類惡性腫瘤第2位，死亡率居第3位［1］。本研究收集本院2014年10月～2015年7月收治的33例胃癌患者，對(duì)患者血漿游離DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，分析其在胃癌診斷中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1. 1一般資料

胃癌組：收集本院2014年10月～2015年7月收治的33例胃癌患者，男22例，女11例，平均年齡（63.18±10）歲。依據(jù)最新胃癌國(guó)際TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期21例、Ⅲ期12例，其中早期12例，進(jìn)展期21例。所有病例均經(jīng)病理確診。對(duì)照組：44例健康對(duì)照為同期本院胃鏡檢查的健康人或慢性淺表性胃炎患者，男20例，女24例，平均年齡（51.55±10）歲。二組一般資料具有可比性。

1.2標(biāo)本采集及血漿游離DNA提取

所有患者胃鏡檢查前采集靜脈血2 ml置于EDTA-K2抗凝采血管，對(duì)照組同樣方法及流程采集靜脈血。血漿游離DNA提?。翰捎肨IANamp Macro DNA Kit試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。所有血漿標(biāo)本均采用同一批號(hào)的試劑盒提取DNA，以減少批間誤差。

1.3血漿游離DNA定量檢測(cè)

以提取的血漿游離DNA為模版，應(yīng)用Applied Biosystems HT7900擴(kuò)增儀及SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線由同張反應(yīng)板上的已知濃度的人類基因組DNA（Promaga）分別稀釋10倍、100倍、400倍、800倍、1 600倍后，在以上反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下擴(kuò)增所得。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異應(yīng)用One-Way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組與對(duì)照組血漿游離DNA含量

33例胃癌患者血漿游離DNA含量為（50.66±24.59）ng/ml， 44例健康體檢者血漿游離DNA含量為（19.13±7.65）ng/ml。胃癌患者的血漿游離DNA含量水平顯著高于對(duì)照組（t=8.018，P＜ 0.05）。對(duì)胃癌患者組和對(duì)照組血漿游離DNA定量結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析。以29.83 ng/ml為診斷胃癌的臨界值，敏感性為72.7%，特異性為93.2%，ROC曲線下面積（AUC）為0.902，95% CI為0.835 ～0.968。

2.2胃癌組不同臨床病理特征與血漿游離DNA含量之間的關(guān)系

不同性別、＜60歲和≥60歲組間、不同分化程度組間血漿DNA游離含量均無(wú)差異；在早期和進(jìn)展期胃癌組間亦未發(fā)現(xiàn)血漿DNA游離水平有差異。在不同TNM分期組間對(duì)比時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期患者血漿游離DNA水平（65.90±25.32）ng/ml高于TNMⅠ/Ⅱ期患者（41.95±19.90）ng/ml。

3　討論

目前，惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中游離核酸水平增高的機(jī)制目前還未完全闡明，一般認(rèn)為，游離核酸釋放入血與腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死等有關(guān)［2-3］。鑒于血漿在凝血過(guò)程中存在淋巴細(xì)胞破裂釋放DNA等影響游離DNA水平的因素［4］，本研究選用了更能體現(xiàn)機(jī)體血液游離DNA的血漿［5］。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者組血漿游離DNA水平高于健康對(duì)照組。這表明血漿游離DNA含量診斷胃癌較為可靠。TNM Ⅲ期組的游離DNA水平高于TNMⅠ～Ⅱ期組和淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組。這提示在某種程度上血漿游離DNA在胃癌早期診斷中具有一定的臨床意義。

除惡性腫瘤以外的其他病理及生理性變化［6］，如妊娠、炎癥性疾病、自身免疫性疾病等都能引起血漿游離核酸水平不同程度的升高［7］。所以單純依靠游離DNA水平診斷胃癌還是不夠準(zhǔn)確的。血漿游離DNA水平檢測(cè)在胃癌的診斷和篩查中具有一定的臨床意義。雖然目前單純依靠血漿游離DNA診斷胃癌還不夠可靠，但隨著各項(xiàng)相關(guān)研究的不斷深入，血漿游離DNA能夠更加有效的指導(dǎo)胃癌及其他惡性腫瘤篩查、診斷、病情監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估。

參考文獻(xiàn)

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［7］ Fleischhacker M，Schmidt B． Circulating nucleic acids（CNAs）and cancer--a survey［J］． Biochim Biophys Acta，2007，1775（1）: 181-232．

Quantitative Analysis of Plasma Cell-free DNA and Its Clinical Value in the Diagnosis of Gastric Cancer

BAI YanliJIN JianjunLIU XianminTIAN XiaoxiaoDepartment of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，China

【Abstract】

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．01．118

【中圖分類號(hào)】R446

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）01-0161-02

作者單位：471000 洛陽(yáng)，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科