李勝男 李玉子

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000)

血漿微小RNA-208a、210、506與急性心肌梗死的相關(guān)性

李勝男 李玉子

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000)

目的探討血漿微小RNA-208a、210、506在急性心肌梗死(AMI)早期診斷中的意義及其與AMI嚴(yán)重程度的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討其在延邊地區(qū)朝鮮族與漢族AMI患者間的表達(dá)差異。方法 將研究對象分為正常對照組和AMI組，AMI組又分為急診手術(shù)亞組、擇期手術(shù)亞組和Gensini評分四個(gè)亞組。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測血漿miR-208a、210、506相對表達(dá)量。結(jié)果 AMI組miR-208a、miR-506相對表達(dá)量較對照組升高(P<0.01，P<0.05)，miR-210較對照組降低(P<0.01)；急診手術(shù)組miR-208a較擇期手術(shù)組升高(P<0.05)。三種miRNAs在朝鮮族與漢族間無明顯差異。MiR-208a與年齡、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、pro-BNP呈顯著正相關(guān)，miR-210與年齡、pro-BNP呈負(fù)相關(guān)，miR-506與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、CK-MB、cTnI、pro-BNP呈正相關(guān)。Gensini評分與miR-208a、miR-506呈顯著正相關(guān)，與miR-210呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論 MiR-208、210、506可作為AMI的診斷標(biāo)記物，其中miR-208可能為早期診斷AMI的生物標(biāo)志物。miR-208a具有評價(jià)冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度并進(jìn)行危險(xiǎn)分層的潛力。AMI患者血漿miR-208a、miR-210、miR-506的表達(dá)水平無地區(qū)、民族差異。

急性心肌梗死；微小RNA；診斷；生物標(biāo)記

急性心肌梗死(AMI)是一類以心肌缺血缺氧及隨之發(fā)生的心肌細(xì)胞損傷為主要病理生理變化的心臟病急癥。除了典型胸痛、心電圖及“金標(biāo)準(zhǔn)”冠脈造影等診斷手段外，傳統(tǒng)的血液學(xué)檢查〔肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)〕已占據(jù)重要地位。微小RNA(miR)是一類普遍存在于生物全血、血漿和血清中的小分子非編碼RNA，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖、凋亡，脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激及動脈粥樣硬化形成等，進(jìn)而調(diào)控眾多的生理和病理生理過程〔1〕。本研究通過檢測血漿miR-208a、miR-210、miR-506的表達(dá)水平，探討其在AMI早期診斷中的意義及其與AMI嚴(yán)重程度的相關(guān)性，同時(shí)對比其在延邊地區(qū)朝鮮族與漢族AMI患者間的表達(dá)是否有差異。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2014年4～9月于延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科行冠狀動脈造影檢查及住院治療的AMI患者50例(AMI組)，同期行健康檢查的健康人群27例(對照組)。所有受試者以血常規(guī)、腎功、肝功等臨床理化檢查為依據(jù)，排除同時(shí)合并感染、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、近期腦血管病以及自身免疫性疾病等。AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012版第3次心肌梗死全球定義。血清心肌酶學(xué)標(biāo)志物(cTnI、CK-MB)升高(至少超過99%參考值上限)，并至少伴有以下一項(xiàng)臨床指標(biāo)：(1)心肌缺血癥狀；(2)缺血性心電圖改變：ST-T改變或新發(fā)的左束支傳導(dǎo)阻滯；(3)病理性Q波；(4)影像學(xué)改變：新的存活心肌喪失或節(jié)段性室壁運(yùn)動障礙；(5)冠脈造影示冠狀動脈主支或分支阻塞或持續(xù)性慢血流或無復(fù)流或栓塞。

1.2 分組 AMI組按民族分為朝鮮族亞組(20例)和漢族亞組(30例)；按冠脈造影檢查時(shí)間分為急診手術(shù)亞組(15例)和擇期手術(shù)亞組(35例)。采用Gensini評分評價(jià)冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度：每處病變的嚴(yán)重程度為病變血管解剖部位系數(shù)與其狹窄程度系數(shù)的乘積，每例患者冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度為每處病變分?jǐn)?shù)之和，最后按照評分分為：A組：積分<30(13例)；B組：30≤積分≤60(24例)；C組：積分>60(13例)。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 每位受試者于入院后行冠脈造影檢查當(dāng)日抽取肘部靜脈血約3 ml，室溫下3 000 r/min離心15 min，取上清液至1.5 ml離心管中，-80℃凍存待用。

1.3.2 總RNA提取 取500 μl樣本加1 ml TRIzol(Invitrogen，USA)及0.2 ml氯仿，室溫強(qiáng)烈混勻，4℃ 、13 000 r/min離心15 min后提取最上層透明水相至新的1.5 ml離心管中；加0.5 ml異丙醇后再次同條件離心后可見離心管貼壁形成的白色沉淀即RNA。棄上清，加多于1 ml的現(xiàn)配70%乙醇，同條件離心后吸除乙醇；徹底干燥后加入15～30 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水；用超微量核酸定量儀檢測濃度后-80℃ 凍存。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈(qRT-PCR)檢測3種miRNAs 取每份RNA原液2 μl，加入特異性引物(上海諾倫公司)及MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等構(gòu)建反應(yīng)體系；在16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min反應(yīng)環(huán)境中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，miR-16設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參。最后，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)反應(yīng)管，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Agilent，Germany)在95℃、3 min，95℃、12 s，60°、40 s反應(yīng)環(huán)境中經(jīng)40個(gè)循環(huán)對目的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 將所采集的Ct值作為樣本表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNAs的相對表達(dá)量。

1.3.5 CK-MB、cTnI檢測 通過全自動生化分析儀(Toshiba，Japan)檢測血漿CK-MB、cTnI值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0及GraphPadPrism6軟件，臨床數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)和受試者工作特征曲線(ROC)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析 AMI組與對照組相比，男性患者所占比例及高齡患者偏多，多有吸煙史，體重指數(shù)、TG、CK-MB及cTnI指標(biāo)較高(P<0.05)；AMI組漢族體重指數(shù)、cTnI值較朝鮮族升高，但高血壓頻率較低(P<0.05)。

2.2 miR-208a、210、506相對表達(dá)量比較 AMI組miR-208a(7.98±10.19)、miR-506(1.53±1.12)高于對照組(1.02±0.61，0.60±0.52)，miR-210(0.50±0.31)低于對照組(1.28±1.23)；急診手術(shù)組miR-208a(9.34±16.10)較擇期手術(shù)組(4.66±5.56)升高，miR-210(0.59±0.26 vs 0.56±0.36)、506(1.71±1.16 vs 1.46±1.08)在兩組間無明顯差異。三種miRNAs相對表達(dá)水平在朝鮮族與漢族間無明顯差異。

2.3 miR-208a、210、506與冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的關(guān)系 對照組及Gensini評分的三個(gè)亞組的miR-208a相對表達(dá)量分別為：對照組1.00±0.61、A組3.73±2.27、B組9.74±13.33、C組9.24±6.89，A、B、C三組均較對照組升高，其中B、C組較A組升高(均P<0.05)，但B組與C組無明顯差異；四組miR-210相對表達(dá)量分別是：1.25±1.22、0.59±0.34、0.52±0.34、0.39±0.22，A、B、C組均較對照組降低，在三組間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；四組miR-506相對表達(dá)量分別是：0.64±0.54、1.17±1.02、1.39±0.99、1.63±1.49，A、B、C組較對照組升高，但三組間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 三種miRNAs診斷AMI的敏感性比較 繪制受試者工作特征曲線(ROC)miR-208a、miR-210、miR-506、CK-MB及cTnI曲線下面積分別為0.917(95%CI：0.856～0.979)、0.753(95%CI：0.624～0.882)、0.807(95%CI：0.699～0.915)、0.758(95%CI：0.653～0.864)、0.750(95%CI：0.644～0.856)。由圖1所示，miR-208a、miR-210、miR-506具有早期診斷AMI的能力，但并不優(yōu)于CK-MB和cTnI。

A：1.miR-208a；2.CK-MB；3.cTnI；4.miR-506；B：1.miR-210圖1 ROC分析

3 討 論

本研究中miR-208a在AMI患者血漿中高表達(dá)，其相對含量較對照組顯著升高，此發(fā)現(xiàn)與Wang等〔2〕及Oerlemans等〔3〕的研究結(jié)果一致，提示miR-208a可作為診斷AMI的新型生物標(biāo)志物。Ji等〔4〕通過基因芯片技術(shù)檢測得出小鼠miR-208只在心肌表達(dá)的高組織特異性，且在誘導(dǎo)心肌損傷3 h后逐漸升高，持續(xù)12 h后逐漸恢復(fù)基礎(chǔ)水平。而這種組織特異性還表現(xiàn)在其他組織器官的低表達(dá)，腎臟特異的miR-10a在發(fā)生腎梗死時(shí)增高，而此時(shí)miR-208的水平卻變化不明顯。心肌壞死后miR-208表達(dá)升高，含量穩(wěn)定，且與心肌梗死面積呈正相關(guān)。李祥云等〔5〕的研究對miR-208與CK-MB、cTnI相比較分析發(fā)現(xiàn)，miR-208不僅對AMI早期診斷具有參考價(jià)值，而且還具有一定的時(shí)間效應(yīng)，不僅發(fā)病1 h即可檢測到其值升高，且具有相對更寬泛的檢測窗口期。本研究血漿miR-208a表達(dá)水平較CK-MB和cTnI開始升高的時(shí)間更早，由此可以推測miR-208a具有早期診斷AMI的潛力。

miR-210的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，近年來在包括缺血性損傷及腫瘤在內(nèi)的多種疾病診治中成為新的靶點(diǎn)〔6〕。Zhao等〔6〕的研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血漿miR-210表達(dá)水平升高，且趨于胎兒水平。除了在心臟疾病的異常表達(dá)外，miR-210也影響急性腦缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，但與心力衰竭不同，急性腦梗死患者血清中miR-210表達(dá)減弱，且與急性腦梗死嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為急性腦梗死的診斷依據(jù)〔7，8〕。急性腦梗死與AMI兩者發(fā)病機(jī)制相似。有研究〔9〕證實(shí)miR-210與低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在缺氧誘導(dǎo)環(huán)境中表達(dá)增高，且協(xié)同提高，具有心肌梗死的治療潛力。Wang等〔10〕認(rèn)為AMI相關(guān)基因的表達(dá)異?？赡軞w于其各自的調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)異常，抑制miR-210的表達(dá)能夠提高AMI模型大鼠的生存率和心臟功能。由上可以看出miR-210不僅具有診斷AMI的潛力，更有望成為AMI臨床治療中的新靶點(diǎn)。

研究表明，實(shí)體腫瘤細(xì)胞因其生長特性實(shí)際上是處于一種相對乏氧的狀態(tài)〔11〕，無論是腫瘤細(xì)胞還是缺血的心肌細(xì)胞內(nèi)，HIF-1α高表達(dá)〔12〕也進(jìn)一步推測兩者具有理化性質(zhì)相似的內(nèi)環(huán)境。本研究結(jié)果顯示AMI組miR-506表達(dá)水平高于對照組，提示miR-506有可能作為AMI診斷的新型生物標(biāo)記物。本研究也發(fā)現(xiàn)民族差異不影響血清三種miR表達(dá)量變化，是否罹患AMI與民族差異無明顯關(guān)系。

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〔2015-12-29修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140414065GH)

李玉子(1965-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事冠心病研究。

李勝男(1990-)，女，碩士，主要從事冠心病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)24-6112-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.031