李博林 劉啟泉 張 晶 閆丹丹 成亞亞 王志坤

(河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011)

蘭術(shù)四草化濁解毒方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠細(xì)胞因子水平的影響

李博林 劉啟泉 張 晶1閆丹丹1成亞亞1王志坤

(河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011)

目的探討蘭術(shù)四草化濁解毒方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠細(xì)胞因子水平的影響。方法 將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、蘭術(shù)四草化濁解毒方大、中、低劑量組，每組10只。除空白組外，其余5組制備潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模后空白組、模型組予蒸餾水灌胃，其余各治療組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)治療2 w。觀察各組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸黏膜組織病理，血清腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-8，IL-10的變化。結(jié)果 與模型組比較，蘭術(shù)四草化濁解毒方能夠改善結(jié)腸黏膜病理變化，減低疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分，降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)。與陽(yáng)性藥組比較，蘭術(shù)四草化濁解毒方大劑量組能夠降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)；蘭術(shù)四草化濁解毒方中低劑量組能夠降低血清TNF-α及IL-8的含量(P<0.05)，但血清IL-10含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 蘭術(shù)四草化濁解毒方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制可能與降低血清TNF-α及IL-8，升高IL-10的含量有關(guān)。

蘭術(shù)四草化濁解毒方；潰瘍性結(jié)腸炎；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-8；白細(xì)胞介素-10

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可以明確的是在UC的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫因素起了重要作用，而細(xì)胞因子則在免疫系統(tǒng)中起著非常重要的調(diào)控作用。多種細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)參與了腸道黏膜炎癥的形成，其中促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的失衡在UC的發(fā)病過程中起了樞紐作用〔1，2〕。課題組前期發(fā)現(xiàn)濁毒相干為害貫穿UC發(fā)展的全過程，“濁毒內(nèi)蘊(yùn)”是本病的主病機(jī)〔3〕。以“濁毒”立論的蘭術(shù)四草化濁解毒方經(jīng)臨床驗(yàn)證顯示出良好療效，本實(shí)驗(yàn)基于平衡細(xì)胞因子探討該方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡Wistar 大鼠60只，雄性，清潔級(jí)，體重120～140 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003,合格證編號(hào)：1205036。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 蘭術(shù)四草化濁解毒方：佩蘭15 g、蒼術(shù)6 g、炒白術(shù)12 g、茯苓20 g、敗醬草15 g、旱蓮草15 g、豨薟草12 g、仙鶴草20 g、黃連6 g、地榆20 g、佛手12 g、白芍20 g、石榴皮12 g、兒茶6 g 、葛根20 g、當(dāng)歸6 g。藥物均購(gòu)自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司研發(fā)的免煎制劑。上述藥物用90℃以上蒸餾水分別配制成中、低劑量人混懸液：5、2.5、1.25 g/ml。柳氮磺吡啶腸溶片，由上海中西三維藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20110619，將片劑用研缽研細(xì)，過100目篩，溶于蒸餾水中配制成濃度為0.15 g/ml的柳氮磺吡啶混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：由美國(guó)Sigma公司生成，批號(hào)：2508-19-2。無(wú)水乙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。腫瘤壞死因子(TNF)-α放射免疫分析試劑盒：由北京華埠力特生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。白細(xì)胞介素(IL)-8放射免疫分析試劑盒：由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)。IL-10定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒：由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 正常適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，分別為空白組(N組)、 模型組(M組)、陽(yáng)性藥組(SASP組)、 蘭術(shù)四草化濁解毒方大劑量組(HD組)、蘭術(shù)四草化濁解毒方中劑量組(MD組)蘭術(shù)四草化濁解毒方低劑量組(LD組)。

1.4.2 模型制備 采用TNBS/乙醇法誘導(dǎo)UC模型〔3〕。將5%TNBS與50%乙醇以體積1∶1配制成TNBS/乙醇混合液作為造模劑。操作方法:除N組外，其他各組大鼠禁食不禁水24 h后稱體質(zhì)量，乙醚麻醉，按照4 ml/kg(相當(dāng)于TNBS100 mg/kg)劑量將造模劑用直徑2 mm的一次性橡膠輸液軟管推入距肛門約8 cm處的腸腔內(nèi)，提起大鼠尾部，倒置30 s使造模劑充分深入大鼠腸腔，再捏緊大鼠肛門平放10 min左右。造模后大鼠歸籠，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。3 d后，隨機(jī)抽取2只M組大鼠處死，取其結(jié)腸標(biāo)本，病理檢查確認(rèn)有充血、水腫及典型潰瘍形成等一系列病理變化即為造模成功。造模時(shí)HD組、LD組各死亡1只。

1.4.3 給藥途徑和方法 N組、M組予蒸餾水2 ml/kg灌胃；HD組予20 g/kg予大劑量混懸液灌胃；MD組予10 g/kg混懸液灌胃；LD組按予5 g/kg混懸液灌胃；SPAP組予SPAP混懸液,按0.3 g/kg灌胃(相當(dāng)于成人用藥量的10倍)。各組給藥1次/d,各組連續(xù)灌胃14 d。

1.4.4 標(biāo)本的采集和處理 治療2 w后，停止給藥將大鼠禁食不禁水24 h后，斷頭處死取血，每只取血4 ml，注入試管中待凝固后，4℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血漿、血清，置-20℃低溫冰箱保存待檢測(cè)。開腹，在距肛門8 cm處取病變部位最明顯處取2 cm標(biāo)本，放入10%中性甲醛固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色。

1.4.5 觀測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.4.5.1 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 DAI評(píng)分參照文獻(xiàn)〔7〕的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.5.2 結(jié)腸黏膜大體觀察及組織病理學(xué)觀察 治療結(jié)束后，處死大鼠，解剖過程中取大鼠全結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈后肉眼觀測(cè)結(jié)腸黏膜的色澤、充血水腫、糜爛、潰瘍、出血點(diǎn)情況；顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)，黏膜下血管及潰瘍等情況。

1.4.5.3 血清TNF-α、IL-8、IL-10指標(biāo)檢測(cè) TNF-α、IL-8含量測(cè)定：采用放射免疫法檢測(cè)。血清IL-10含量測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，具體方法和操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠結(jié)腸黏膜大體觀與組織病理學(xué)觀察 肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜M組最差；HD組黏膜表面光滑，可見少量漿液滲出，皺襞整齊，恢復(fù)接近N組；MD組黏膜欠光滑，皺襞比較整齊，可見少許點(diǎn)狀出血區(qū)。SASP組和LD組結(jié)腸黏膜狀況介于MD組和M組之間,兩組無(wú)明顯區(qū)別。

在組織病理學(xué)方面:N組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，黏膜下血管豐富清晰，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚，未見到充血水腫、潰瘍、糜爛點(diǎn)。M組大鼠鏡下潰瘍數(shù)量最多，潰瘍面大，組織充血水腫明顯，大部分黏膜缺損，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體破壞。SASP和LD組仍可見到潰瘍，組織充血水腫較明顯，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。MD組潰瘍較少，潰瘍較淺表，可見部分已愈合的潰瘍組織，輕度組織充血水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。HD組潰瘍較少，可見已愈合的潰瘍組織，組織充血水腫不明顯，其基本形態(tài)與N組相似。

2.2 各組大鼠DAI評(píng)分及血清TNF-α比較 其他各組(除HD組)大鼠血清TNF-α含量均明顯升高，各組DAI評(píng)分升高(均P<0.05)。與M組比較，各治療組大鼠血清TNF-α含量及DAI評(píng)分均明顯降低(P<0.05)。HD組與MD組、LD組、SASP組比較，能明顯降低大鼠血清TNF-α含量及DAI評(píng)分(P<0.05)；與SASP組比較，LD組在降低大鼠血清TNF-α含量及DAI評(píng)分上，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別nDAITNF?α(ng/ml)N組100 00±0 003)0 55±0 113)M組82 50±0 311)1 30±0 121)SASP組101 57±0 391)2)3)1 14±0 131)2)3)HD組90 37±0 351)2)0 65±0 112)MD組100 80±0 281)2)3)0 82±0 101)2)3)LD組91 44±0 331)2)3)1 02±0 201)2)3)

與N組比較:1)P<0.05；與M組比較:2)P<0.05；與HD組比較:3)P<0.05；下表同

2.3 各組血清IL-8、IL-10比較 與N組比較，其他各組大鼠血清IL-8含量明顯升高，IL-10含量明顯降低(P<0.05)；與M組比較，各治療組大鼠血清IL-8含量明顯降低，IL-10含量均明顯升高(P<0.05)；HD組與MD組、LD組、SASP組比較，能明顯降低大鼠血清IL-8含量，升高大鼠血清IL-10含量(P<0.05)；與SASP組比較，LD組血清IL-8含量的降低與IL-10含量的升高(P>0.05)。見表2。

組別nIL?8(ng/ml)IL?10(pg/ml)N組100 17±0 032)28 02±2 022)M組80 45±0 061)12 80±2 571)SASP組100 39±0 041)2)3)20 81±3 281)2)3)HD組90 27±0 061)2)24 69±4 051)2)MD組100 33±0 051)2)3)19 05±4 691)2)3)LD組90 38±0 071)2)3)17 26±2 001)2)3)

3 討 論

在UC的發(fā)病過程中，細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致免疫失調(diào)，是本病發(fā)生的關(guān)鍵樞紐環(huán)節(jié)〔4〕。TNF-α是一個(gè)多效的炎癥性細(xì)胞因子，對(duì)腸道上皮細(xì)胞增殖和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用，參與感染、炎癥和自身免疫調(diào)節(jié)。因TNF-α在T細(xì)胞依賴的腸道炎癥中起著重要的促進(jìn)作用，而成為細(xì)胞因子網(wǎng)路中的關(guān)鍵因子或禍?zhǔn)滓蜃?，并且TNF-α是UC發(fā)病的主要炎性啟動(dòng)因子〔5,6〕。IL-8是多核白細(xì)胞移動(dòng)因子，是一種重要的介導(dǎo)淋巴細(xì)胞功能的效應(yīng)介質(zhì)，其作用主要是趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞〔7〕，對(duì)中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞均有趨化作用〔8〕。目前認(rèn)為TNF-α、IL-1、IL-6誘發(fā)的炎癥反應(yīng)很大程度上是通過IL-8為代表的趨化因子所介導(dǎo)的〔9，10〕。IL-10作用主要是抑制致炎因子的釋放和炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的增殖分化〔11〕，是目前公認(rèn)的抑炎因子。IL-10抗炎活性的關(guān)鍵所在是對(duì)TNF和IL-1產(chǎn)生的抑制效應(yīng)，能夠明顯抑制TNF-α的分泌，并且可抑制肥大細(xì)胞激活，從而參與變態(tài)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在維持正常腸道黏膜免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用〔12〕。

以上論述可見UC是以TNF-α為主的炎性因子啟動(dòng)了病變的過程并參與炎癥細(xì)胞相互作用，加重局部腸黏膜炎癥反應(yīng)；同時(shí)刺激相關(guān)細(xì)胞分泌IL-8，升高的IL-8通過趨化作用，導(dǎo)致組織細(xì)胞浸潤(rùn)，加重腸黏膜炎性損傷，而IL-10則通過抑制炎癥相關(guān)因子如TNF-α、IL-8等減輕炎癥反應(yīng)，降低組織損傷。

潰瘍性結(jié)腸炎是西醫(yī)病名，依據(jù)其臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“久痢”、“滯下”、“腸澼”、“腸風(fēng)”等范疇。筆者認(rèn)為“濁毒內(nèi)蘊(yùn)”是本病的主病機(jī)，濁毒相干為害貫穿于UC發(fā)展的全過程。本病病位在大腸，與脾胃關(guān)系密切，初病多實(shí)，久病多虛或虛實(shí)夾雜。病機(jī)為脾胃失和，運(yùn)化失職，水濕內(nèi)停，阻滯氣機(jī)，郁而化濁，久而成毒，濁毒久伏，蘊(yùn)結(jié)腸腑，損傷脂膜血絡(luò)，則成膿血。病理上呈現(xiàn)痰、濁、瘀、毒互結(jié)為害。佩蘭、白術(shù)、茯苓、蒼術(shù)健脾助運(yùn)而化濕祛濁，其中佩蘭、蒼術(shù)芳香化濁，助白術(shù)、茯苓化濕健脾；白術(shù)、茯苓益氣健脾化濕，助佩蘭、蒼術(shù)運(yùn)濕化濁。黃連、敗醬草清熱解毒。佛手行氣導(dǎo)滯。仙鶴草、旱蓮草、白芍補(bǔ)虛斂腸。地榆、兒茶、當(dāng)歸活血祛瘀而止瀉療瘡。石榴皮、葛根清腸止瀉。白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血和血，柔肝止痛，配旱蓮草兼補(bǔ)肝腎。諸藥相合，脾胃健運(yùn)，水濕得化；肝脾和調(diào)，氣機(jī)暢利；氣血和暢，痰瘀得消，毒邪得解，而濁毒自愈。

蘭術(shù)四草化濁解毒方能夠降低模型大鼠血清TNF-α、IL-8等促炎因子同時(shí)提高IL-10等抗炎因子，以達(dá)到平衡細(xì)胞因子而起到抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用。

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〔2015-07-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥人教發(fā)(2014)20號(hào))；河北省政府重大項(xiàng)目(2014571034)

王志坤(1974-)，女，碩士，主任醫(yī)師，教授，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

李博林(1986-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

R256.3

A

1005-9202(2016)24-6085-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.018

1 河北醫(yī)科大學(xué)