謝劍云 陳偉東 楊曉莉

(福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院泌尿外科，福建 福州 350004)

死亡相關(guān)蛋白激酶1在膀胱癌中的表達(dá)及發(fā)病機(jī)制

謝劍云 陳偉東 楊曉莉1

(福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院泌尿外科，福建 福州 350004)

目的探討死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)在膀胱癌中的表達(dá)及發(fā)病機(jī)制。方法 選取86例膀胱癌患者，提取膀胱癌組織和癌旁正常組織總RNA以及蛋白，采用RT-PCR法以及Western印跡法測定2組患者DAPK1 mRNA 以及蛋白在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果 86例膀胱癌組織標(biāo)本中DAPK1陽性表達(dá)率為27.91%(24/86)，顯著低于癌旁組織的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。膀胱癌組織標(biāo)本中DAPK1 mRNA陽性表達(dá)相對灰度值明顯低于癌旁組織標(biāo)本(t=21.33，P<0.05)，膀胱癌組織標(biāo)本中DAPK1蛋白表達(dá)顯著低于癌旁組織標(biāo)本(t=17.99，P<0.05)。TNM分期為Ⅰ～Ⅱ級者DAPK1 mRNA表達(dá)率顯著高于Ⅲ級(P<0.01)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者DAPK1 mRNA表達(dá)率顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)。癌組織DAPK1 mRNA表達(dá)與患者的年齡、性別以及腫瘤部位、大小無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 DAPK1在膀胱癌組織標(biāo)本中較癌旁組織表達(dá)低，推測其與抑制膀胱癌表達(dá)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

DAPK1；膀胱癌；發(fā)病機(jī)制

膀胱癌(CUB)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，病理類型包括膀胱尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌以及腺癌等〔1〕。早期患者較難察覺，當(dāng)出現(xiàn)尿路刺激征、血尿、水腫等明顯癥狀前來就診，已是晚期，臨床治療復(fù)雜、預(yù)后差〔2〕。死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與γ-干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并起關(guān)鍵作用〔3〕。有研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1于包括肺癌、胃癌、CUB等在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)較正常組織低〔4〕。但國內(nèi)關(guān)于DAPK1 在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤尤其是CUB中的研究鮮有報道。本文通過檢測CUB患者腫瘤組織DAPK1的表達(dá)，探討DAPK1在CUB中的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年8月至2015年7月我院泌尿外科收治的86例CUB患者，男66例，女20例，年齡28～77〔平均(54.24±7.72)〕歲。其中移行上皮癌27例、鱗狀上皮癌21例、腺上皮癌18例、未分化癌20例。本研究已獲得本醫(yī)院的倫理學(xué)相關(guān)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)授權(quán)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 均符合《膀胱癌診斷治療指南》中CUB的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血常規(guī)檢測白細(xì)胞計數(shù) ≥4.0×109/L，血小板計數(shù)≥8.0×109/L，血紅蛋白≥90 g/L；卡氏功能狀態(tài)量表(KPS)評分>70分，預(yù)計生存期超過3個月，均有完整的影像學(xué)資料；膀胱鏡及臨床病理學(xué)檢查均顯示為CUB；年齡≥18歲；患者以及家屬對本研究具體情況了解知情并自愿參與，簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①精神、神志異常不能配合者；②患有嚴(yán)重心、肝、腎、肺、腦疾病者；③合并肝癌、腎癌、腦癌等其他惡性腫瘤者；④患有艾滋病、梅毒、病毒性肝炎、結(jié)核等傳染病者；⑤患有再障、白血病等血液性疾病者；⑥近3個月接受過化療、放療、介入治療等。

1.4 腫瘤組織DAPK1表達(dá)檢測 參考《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》〔5〕。CUB手術(shù)后，取腫瘤標(biāo)本離體后洗凈，確定其大小以及切緣，分別切取癌組織以及腫瘤邊緣超過3 cm的正常膀胱壁組織，分裝入無菌管，進(jìn)行標(biāo)記，迅速置于-80℃低溫冰箱備用，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR檢測DAPK1 mRNA表達(dá))。提取總RNA，在冰上取每例樣本組織50 mg入勻漿器，研磨，恢復(fù)正常溫度后，采用4 000 r/min，4℃離心5 min分離雜質(zhì)，離心后取上層清液，加入500 μl預(yù)冷的異丙醇震蕩恢復(fù)室溫，12 000 r/min，4℃離心10 min以沉淀DNA，離心后取上層清液，加入1 ml 75%乙醇洗滌RNA 沉淀，震蕩，取離心管底部至白色沉淀物于75%乙醇上漂浮，7 500 r/min，4℃離心5 min吸出乙醇，加入適量的無RNase水以溶解RNA，置于-80℃低溫冰箱備用。采用分光光度計法對RNA濃度、純度進(jìn)行測定。用免疫組化SP法檢測DAPK1蛋白表達(dá)。稱取40 mg標(biāo)本組織，入勻漿器，研磨，恢復(fù)正常溫度后，12 000 r/min，4℃離心10 min備用，將配置好的0.5 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μl置入標(biāo)準(zhǔn)孔96孔板中，每份磷酸鹽緩沖液(PBS)補(bǔ)足至20 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔200 μl二喹啉甲酸(BCA)液，37℃離心30 min，采用酶標(biāo)儀對各孔波長562 nm處吸光度進(jìn)行記錄，參照已繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白的濃度。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳得出mRNA表達(dá)差異的電泳圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件。計數(shù)資料用χ2檢驗，組間等級資料比較采用方差分析，計量資料比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 DAPK1 mRNA表達(dá)情況 86例CUB組織標(biāo)本中DAPK1 mRNA陽性表達(dá)率為27.91%(24/86)，明顯低于癌旁組織標(biāo)本中的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。

2.2 DAPK1 mRNA的相對灰度值以及DAPK1蛋白表達(dá)情況 24例CUB組織標(biāo)本中DAPK1 mRNA陽性表達(dá)相對灰度值(0.26±0.03)明顯低于58例癌旁組織標(biāo)本中DAPK1 mRNA陽性表達(dá)相對灰度值(0.58±0.06)(t=21.33，P<0.05)，CUB組織標(biāo)本中DAPK1蛋白表達(dá)相對光密度值(0.36±0.04)顯著低于癌旁組織標(biāo)本(0.65±0.06)(t=17.99，P<0.05)。圖1、圖2。

N：癌旁組織；C：癌組織；下圖同圖1 DAPK1 mRNA表達(dá)電泳圖

圖2 DAPK1蛋白Western印跡電泳圖

2.3 DAPK1 mRNA表達(dá)與CUB臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TNM分期為Ⅰ～Ⅱ級者DAPK1 mRNA表達(dá)率〔38.10%(24/63)〕顯著高于Ⅲ級(0%)(P<0.01)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者DAPK1 mRNA表達(dá)率〔38.71%(24/62)〕顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(0)(P<0.01)，癌組織DAPK1 mRNA表達(dá)與患者的年齡、性別以及腫瘤部位、大小無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 DAPK1 mRNA表達(dá)與CUB臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔%(n/N)〕

臨床病理參數(shù)nDAPK1mRNA表達(dá)χ2值P值年齡 <50歲4131 71(13/41) ≥50歲4524 44(11/45)0 56>0 05性別 男6627 27(18/66) 女2030 00(6/20)0 60>0 05腫瘤大小 <2cm5435 19(19/54) ≥2cm3215 63(5/32)4 41>0 05

3 討 論

CUB高發(fā)年齡為50～70歲，隨著年齡增高發(fā)病率增高，男性CUB發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性，約為其的3～4倍〔6〕。CUB的早期篩查在技術(shù)上和可行性具有很大的難度，其發(fā)病率以及死亡率仍居高不下。CUB早期患者體內(nèi)即出現(xiàn)生化指標(biāo)以及代謝紊亂，體液、排泄物質(zhì)以及組織等出現(xiàn)質(zhì)與量的改變；此外，腫瘤相關(guān)抗原、癌基因以及同工酶等均廣泛存在于宿主細(xì)胞內(nèi)〔7〕。其中，發(fā)揮最關(guān)鍵性作用的是遺傳突變中癌基因的激活和抑癌基因的失活。

最新研究表明，抑癌基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用不低于原癌基因〔8〕。抑癌基因在癌癥組織中呈低下或者缺失的狀態(tài)，如結(jié)直腸癌組織中，結(jié)腸癌缺失基因(DCC)以及p53等抑癌基因丟失，因此，抑癌基因在一定程度上能夠反映癌癥的表達(dá)以及發(fā)展。DAPK1即為抑癌基因的一種〔9〕，是一種細(xì)胞凋亡正性調(diào)節(jié)因子，能夠通過激活細(xì)胞因子以及原癌基因誘導(dǎo)的過度增生等死亡信號誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞癌變。曾有研究顯示，小鼠CUB模型中，DAPK1能夠抑制腫瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，來源于CUB以及腎細(xì)胞癌細(xì)胞系中的20%～30%患者存在DAPK1 mRNA低下甚至缺失〔11〕。證實DAPK1 mRNA與蛋白的表達(dá)能夠抑制CBU的發(fā)生。

臨床針對DAPK1的研究多針對DAPK1甲基化與腫瘤的關(guān)系，于肺癌、胃癌、宮頸癌以及CUB等惡性腫瘤和惡性腫瘤的細(xì)胞系中出現(xiàn)啟動子CpG區(qū)出現(xiàn)高甲基化〔4〕。本研究證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及晚期CUB患者的癌組織中DAPK1的表達(dá)較低，提示DAPK1的表達(dá)具有抑制癌組織轉(zhuǎn)移以及發(fā)展的作用。有研究顯示，DNA異常甲基化存在可逆性，應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)甲基化異常，使出現(xiàn)甲基化的失活抑癌基因恢復(fù)其正常功能〔12〕。因此，針對包括DAPK1在內(nèi)與CUB發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的抑癌基因異常甲基化和表達(dá)水平聯(lián)合檢測，可以提高CUB早期篩查的準(zhǔn)確性以及靈敏性，同時助于CUB病因、基因靶向治療以及預(yù)后的探究。

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〔2015-10-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省自然科學(xué)基金(No.2016J0105)

謝劍云(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)24-6161-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.055

1 福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤外科