金 琳 王海萍

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)科及心血管中心，山東 濟(jì)南 250000)

老年糖尿病腎病患者轉(zhuǎn)化生長因子β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化改變及機(jī)制

金 琳 王海萍

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)科及心血管中心，山東 濟(jì)南 250000)

目的觀察老年糖尿病腎病患者轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化改變情況，探討甲基化在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 老年2型糖尿病患者182例，分為單純糖尿病組84例、糖尿病腎病組98例，選取同期體檢的老年健康志愿者60名為健康對照組。提取3組外周血基因組DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾處理。采用甲基化特異性PCR技術(shù)初篩3組TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化人群，用亞硫酸氫鹽修飾后測序技術(shù)檢測3組TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化水平。ELISA法檢測3組血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平；分析糖尿病腎病組TGF-β1蛋白表達(dá)相關(guān)影響因素。結(jié)果 單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1基因第一外顯子區(qū)甲基化比例均明顯低于健康對照組(P<0.05)，糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進(jìn)一步降低。單純糖尿病組甲基化水平明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病甲基化水平明顯低于健康對照組和單純糖尿病組(P<0.05)。單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1蛋白水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進(jìn)一步升高。血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平與UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明顯正相關(guān)，與eGFR、基因甲基化呈明顯負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步多元逐步回歸分析顯示，eGFR和基因甲基化與血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平存在明顯相關(guān)性，是影響TGF-β1表達(dá)的因素。血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平與病理分級呈明顯正相關(guān)；糖尿病腎病組12個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化含量與病理分級相關(guān)。結(jié)論 TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化是高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞 TGF-β1基因表達(dá)激活的重要機(jī)制，參與老年糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

糖尿病腎?。籇NA甲基化；轉(zhuǎn)化生長因子β1

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是終末期腎病的主要原因之一〔1〕。研究顯示，糖尿病腎病發(fā)生率與患者年齡和糖尿病持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)〔2〕。轉(zhuǎn)化生子因子(TGF)-β1是介導(dǎo)糖尿病腎病腎小球硬化的主要細(xì)胞因子，TGF-β1基因激活是糖尿病腎病早期系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變可能是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中環(huán)境與遺傳因素相互作用的橋梁，特別是基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化可能參與病情的發(fā)生發(fā)展過程〔3〕。本研究使用甲基化特異性PCR技術(shù)(MSP)和亞硫酸氫鹽修飾后測序技術(shù)(BSP)檢測TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化情況，旨在闡明甲基化變化在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月本院收治的2型糖尿病老年患者182例。根據(jù)UACR水平分為單純糖尿病組(UACR<30 μg/mg)84例和糖尿病腎病組(UACR>30 μg/mg)98例，選取同期在本院體檢的老年健康志愿者60例為健康對照組。單純糖尿病組中男40例，女44例；年齡60～78歲，平均(67.82±8.50)歲；空腹血糖(FPG)(6.39±0.95)mmol/L。糖尿病腎病組中男48例，女50例；年齡60～76歲，平均(66.51±9.37)歲；FPG(6.77±1.05)mmol/L。健康對照組中男26例，女34例；年齡60～75歲，平均(64.95±11.60)歲。三組性別構(gòu)成、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；單純糖尿病組與糖尿病腎病組患者FPG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 基因組DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾 收集受試者空腹肘靜脈血2 ml，使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司)提取外周血白細(xì)胞DNA，分光光度法檢測DNA純度，-80℃保存。使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進(jìn)行DNA亞硫酸氫鈉修飾處理，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)修飾后變?yōu)槟蜞奏?，甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生改變。

1.3 MSP初篩各組TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化人群 使用ABI Primer Express 2軟件預(yù)測TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)CpG富含區(qū)域，尋找跨越啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)的CpG富含區(qū)域，見圖1。使用該軟件設(shè)計(jì)MSP甲基化和非甲基化TGF-β1引物，引物區(qū)段為CpG最大富含區(qū)，位于第一外顯子區(qū)，引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR反應(yīng)體系20 μl，包含經(jīng)修飾后的DNA模板1 μl，含Mg2+的PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各1 μl，dNTP 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，蒸餾水10 μl。常規(guī)PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，取10 μl產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)掃描成像。同一DNA分別用甲基化TGF-β1引物和非甲基化TGF-β1引物行PCR。

1.4 BSP檢測TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化水平 使用ABI Primer Express 2軟件以TGF-β1表達(dá)調(diào)控區(qū)CpG富含區(qū)域?yàn)榘邢蛐蛄性O(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增TGF-β1基因215～208序列，包括啟動(dòng)子和第1外顯子序列，第1外顯子啟始位點(diǎn)為1，共424 bp，見圖1。PCR反應(yīng)體系50 μl，其中經(jīng)修飾后的DNA模板1 μl，含Mg2+的PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各1 μl，dNTP 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，蒸餾水40 μl。常規(guī)PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增42個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后紫外燈下觀察目的片段，取10 μl送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。使用MUMmer軟件比對基因序列。

圖1 假定全部CG均甲基化經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的TGF-β1基因-215～208序列

1.5 血清TGF-β1蛋白檢測及糖尿病腎病病理分級 采用ELISA試劑盒檢測血清TGF-β1蛋白水平。根據(jù)腎小球病變程度，結(jié)合腎小管間質(zhì)和血管病變進(jìn)行分級：1級：單純腎小球基底膜增厚；2級：系膜輕度增生或腎小球硬化程度小于25%，無結(jié)節(jié)性硬化；3級：系膜重度增生或腎小球硬化程度25%～50%，無結(jié)節(jié)性硬化；4級：無結(jié)節(jié)性硬化或腎小球硬化程度51%～75%；若存在腎小管間質(zhì)病變或血管病變則加1級。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，進(jìn)行Pearson檢驗(yàn)和多元逐步回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 MSP檢測各組TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化狀態(tài) 健康對照組60例受試者中44例(73.33%)TGF-β1基因第一外顯子區(qū)甲基化；單純糖尿病組84例患者中36例(42.86%)呈甲基化；糖尿病腎病組98例患者中12例(12.24%)呈甲基化。單純糖尿病組和糖尿病腎病組TGF-β1基因第一外顯子區(qū)甲基化比例均明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進(jìn)一步降低(P<0.05)。

2.2 BSP檢測TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化程度 3組樣本BSP引物擴(kuò)增產(chǎn)物測序TGF-β1基因甲基化改變集中在第59～189位點(diǎn)之間，共12個(gè)CpG位點(diǎn)。健康對照組甲基化水平為(67.81±10.25)%；單純糖尿病組為(36.74±7.18)%，明顯低于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組為(13.63±8.28)%，明顯低于健康對照組和單純糖尿病組(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組血清TGF-β1蛋白水平 健康對照組血清TGF-β1蛋白水平為(285.27±63.26)ng/L，單純糖尿病組為(1 351.18±115.02)ng/L，糖尿病腎病組為(2 874.62±380.25)ng/L；單純糖尿病組和糖尿病腎病組均明顯高于健康對照組(P<0.05)；糖尿病腎病組與單純糖尿病組相比進(jìn)一步升高(P<0.05)。

2.4 糖尿病腎病組TGF-β1表達(dá)相關(guān)因素分析 血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平與UACR、BUN、Scr、FBS、PBS呈明顯正相關(guān)(r=0.729、0.583、0.761、0.953、0.697，P均<0.01)；與eGFR、基因甲基化呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.816、-0.931，P均<0.01)。將上述有相關(guān)性的因素作為自變量進(jìn)一步行多元逐步回歸分析，結(jié)果顯示，eGFR和基因甲基化與血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平存在明顯相關(guān)性。見表1。

2.5 糖尿病腎病患者病理分級相關(guān)因素分析 血清TGF-β1蛋白表達(dá)水平與病理分級呈明顯正相關(guān)(r=0.958，P<0.01)；列聯(lián)表分析顯示，糖尿病腎病組12個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化含量與病理分級相關(guān)(χ2=24.775，P<0.05)。見表2。

圖2 TGF-β1第一外顯子區(qū)甲基化水平(亞硫酸氫鹽修飾后測序)

表1 血清TGF-β1表達(dá)水平影響因素的多元逐步回歸分析

表2 各級糖尿病腎病患者甲基化含量分布(n)

病理分級12個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化含量比例4/123/122/121/120合計(jì)1級46000102級26600143級4108140364級0012141238合計(jì)102226281298

3 討 論

動(dòng)物模型研究顯示，腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為糖尿病腎病發(fā)病早期的主要表現(xiàn)，系膜細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)大量合成和聚積可誘發(fā)糖尿病腎病的主要病理特征，即腎小球硬化〔4〕，在此過程中，TGF-β1基因表達(dá)激活是高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要信號。本次研究顯示，糖尿病腎病患者血清TGF-β1蛋白水平明顯高于單純糖尿病患者和健康人；相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，血清TGF-β1蛋白水平與糖尿病腎病患者病理改變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明了TGF-β1參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。高糖誘導(dǎo)TGF-β1基因表達(dá)激活的分子機(jī)制目前仍未明確。相關(guān)研究顯示，表觀遺傳學(xué)修飾，特別是表達(dá)調(diào)控區(qū)的DNA甲基化，在染色體活性喪失、基因組印跡、基因調(diào)控和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用〔5〕。相關(guān)檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者體內(nèi)CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平低于健康對照組，而CTGF是一種分布廣泛的致纖維化生子因子，與糖尿病腎病腎小球硬化之間存在相關(guān)性，說明DNA低甲基化可能參與高糖激活分子基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制〔6〕。DNA甲基化多在CpG富含區(qū)域的胞嘧啶上，多定位在啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)。本次研究先用MSP法大體檢測研究對象該區(qū)域甲基化情況，結(jié)果顯示糖尿病腎病組甲基化比例最低，進(jìn)一步采用BSP測序顯示，甲基化修飾多發(fā)生在TGF-β1第一外顯子區(qū)，證實(shí)了糖尿病腎病組和單純糖尿病患者TGF-β1第一外顯子區(qū)甲基化水平明顯低于健康對照組，且糖尿病腎病患者TGF-β1甲基化水平與血清TGF-β1蛋白水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示糖尿病腎病患者TGF-β1基因DNA去甲基化與TGF-β1基因表達(dá)激活相關(guān)。

表達(dá)程度高的基因其甲基化程度越低，該關(guān)系也體現(xiàn)在基因第一外顯子CpG富含區(qū)域〔7〕，說明該區(qū)域DNA去甲基化可促進(jìn)表達(dá)，該結(jié)論與本次研究發(fā)現(xiàn)一致。本研究發(fā)現(xiàn)了糖尿病腎病患者TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)去甲基化是高糖誘導(dǎo)TGF-β1基因表達(dá)激活的機(jī)制之一，低甲基化的TGF-β1基因可提升血清TGF-β1蛋白表達(dá)量，進(jìn)而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

1 李錦華.糖皮質(zhì)激素治療血小板減少并發(fā)類固醇糖尿病臨床研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016；17(4)：520-3.

2 張 超，胡 昭，董 帥，等.終末期腎病維持性血液透析患者生存率和死亡的影響因素〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(5)：1241-3.

3 Romagnani P,Remuzzi G.Renal progenitors in non-diabetic and diabetic nephropathies〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2013；24(1)：13-20.

4 Cherney DZI，Perkins BA，Soleymanlou N，etal.Renal hemodynamic effect of sodium-glucose cotransporter 2 inhibition in patients with type 1 diabetes mellitus〔J〕.Circulation，2014；129(5)：587-97.

5 Katherine KJ，Liu YL，Zhang JZ,etal.Renal C3 complement component：feed forward to diabetic kidney disease〔J〕.Am J Nephrol，2015；41(1)：48-56.

6 Zeng R，Duan L，Sun LN,etal.A meta-analysis on the relationship of eNOS 4b/a polymorphism and diabetic nephropathy susceptibility〔J〕.Renal Fail，2014；36(10)：1520-35.

7 Rosenberg AZ，Naicker S，Winkler CA,etal.HIV-associated nephropathies：epidemiology，pathology，mechanisms and treatment〔J〕.Nat Rev Nephrol，2015;11(3)：150-60.

〔2016-08-16修回〕

(編輯 郭 菁)

Changes of methylation and mechanism of expression of transforming growth factorβ1 gene in elderly patients with diabetic nephropathy

JIN Lin, WANG Hai-Ping.

Department of Internal Medicine,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250000,Shandong, China

Objective To observe the changes of methylation status in the regulation of transforming growth factor β1 gene expression in elderly patients with diabetic nephropathy (DN), and explore the role of methylation in the pathogenesis of DN. Methods 182 cases of elderly patients with type 2 diabetes were selected and divided into diabetes (DM) group with 84 cases and DN group with 98 cases. 60 healthy elderly healthy volunteers were selected into control group. Genomic DNA from peripheral blood of the study object was extracted and modified by hydrogen sulfate. Methylation specific PCR technique was used to detect the expression of TGF-β1 gene, and the DNA methylation level was detected by the sequencing technology after the modification of the TGF-β1 gene. ELISA method was used to detect the expression level of TGF-β1 protein. The correlation between the expression of TGF-β1 protein and the pathological grade was analyzed.Results TGFβ1 gene and significant promoter region methylation ratio in DM group and DN group were significantly lower than those of control group (P<0.05); Compared with DM group, DN group had further reduce. Methylation level of DM group was significantly lower than that in control group (P<0.05); Methylation level of DN group was significantly lower than that in control group and DM group (P<0.05). The protein levels of TGF-β1 in DM group and DN group were significantly higher than those in control group (P<0.05). protein levels of TGF-β1 of DN group was higher than that of DM group (P<0.05).The level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with UACR,BUN,Scr,FBS,PBS,and eGFR,gene methylation was significantly negatively correlated. Multiple stepwise regression analysis showed that there was a significant correlation between eGFR and gene methylation and the expression level of TGF-1 protein in serum,which was the influence factor of TGF-β1 expression. The expression level of serum TGF-β1 protein was significantly positively correlated with the pathological grading, and the methylation levels of the 12 CpG sites in the DN group were related to the pathological grading. Conclusions The methylation of TGF-β1 gene expression regulation region is an important mechanism of high glucose induced TGF-β1 gene expression in mesangial cells, which is involved in the occurrence and development of diabetic nephropathy in the elderly.

Diabetic nephropathy;DNA methylation;Transforming growth factor beta 1

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81200530)

王海萍(1981-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腎臟病基礎(chǔ)與臨床研究。

金 琳(1972-)，女，主管護(hù)師，主要從事心血管內(nèi)科基礎(chǔ)及臨床研究。

R587

A

1005-9202(2016)24-6133-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.041