鄒艷紅 劉潔薇 李春玉 李 涵 賈琳琳

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 佳木斯 154002)

刺五加注射液對(duì)阿米卡星所致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的拮抗作用

鄒艷紅 劉潔薇 李春玉 李 涵 賈琳琳1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 觀察刺五加注射液(ASS)對(duì)阿米卡星所致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的拮抗作用。方法 40只新生豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、阿米卡星組、刺五加注射液組、刺五加注射液和阿米卡星聯(lián)合用藥組。在耳蝸底回采用內(nèi)耳微量注射阿米卡星的方式建立豚鼠耳聾模型，連續(xù)用藥5 d后采用聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)各組聽(tīng)閾閾值并對(duì)毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)前ABR測(cè)定各組聽(tīng)功能正常；阿米卡星組ABR閾值升高，與正常對(duì)照組和刺五加注射液組差異顯著，掃描電鏡顯示阿米卡星組耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛出現(xiàn)融合、 散亂、倒伏甚至缺失現(xiàn)象；ASS可顯著改善阿米卡星所致聽(tīng)力損傷和毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論 ASS可拮抗阿米卡星所致新生豚鼠耳蝸毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷造成的聽(tīng)力損害。

刺五加注射液；阿米卡星；毛細(xì)胞；新生豚鼠

刺五加注射液(ASS)是臨床上常用于治療心腦血管疾病的純中藥制劑，其主要藥理作用為擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)血糖血脂濃度及自由基清除等。ASS可延緩氨基甙類抗生素(AmAn)耳毒性的發(fā)生發(fā)展及對(duì)外源性谷氨酸所致豚鼠耳蝸復(fù)合動(dòng)作電位改變和耳蝸結(jié)構(gòu)損傷具有拮抗作用〔1,2〕。 本研究觀察ASS對(duì)阿米卡星所致豚鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 15只耳廓反射正常、無(wú)噪聲接觸史的健康白色紅目懷孕豚鼠，體重500～550 g，普通級(jí)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(遼) 2003-0009。 懷孕母鼠置于安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，生出子代豚鼠45只，于出生后第9天斷乳后，隨機(jī)選擇40只幼鼠分為正常對(duì)照組、刺五加注射液組、阿米卡星組、刺五加注射液和阿米卡星聯(lián)合用藥組。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 刺五加注射液，黑龍江省烏蘇里江制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)Z23021162，20 ml含總黃酮100 mg)；硫酸阿米卡星注射液：成都天臺(tái)山制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)H51020724，20萬(wàn)U/2 ml)； 戊二醛固定液：上海遠(yuǎn)幕生物科技有限公司；其他相關(guān)試劑如磷酸鹽緩沖液(PBS)等購(gòu)自武漢博士德生物有限公司；掃描電鏡：型號(hào)JSM-T300，日本產(chǎn)；聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)誘發(fā)記錄系統(tǒng)：包括聲刺激器、示波器、函數(shù)記錄儀、疊加儀，日本產(chǎn)；納升微量注射泵：型號(hào)NL2010MC4，美國(guó)產(chǎn)。

1.3 模型制備 新生豚鼠在低溫乙醚麻醉狀態(tài)下，應(yīng)用納升微量注射泵在耳蝸底回微創(chuàng)打孔方式經(jīng)內(nèi)耳直接給藥，給藥速度為60 nl/min〔3〕。給藥劑量〔3,4〕設(shè)定如下：正常對(duì)照組灌注總量為200 nl的蒸餾水；阿米卡星組灌注含阿米卡星濃度為0.1 mg/ml的蒸餾水溶液200 nl；刺五加注射液組灌注總黃酮濃度為2 mg/ml的蒸餾水溶液200 nl；聯(lián)合用藥組灌注含阿米卡星濃度為0.1 mg/ml和總黃酮濃度為2 mg/ml的蒸餾水溶液200 nl，各組均連續(xù)灌注5 d。

1.4 ABR閾值檢測(cè) 于灌注給藥前和灌注給藥結(jié)束后第1天行ABR閾值檢測(cè)。乙醚麻醉后置于隔音電屏蔽室內(nèi)，利用刺激器發(fā)出主頻率為2 kHz、初始音強(qiáng)度分別為100 dBnHL的純音短聲刺激信號(hào)，觀察時(shí)程20 ms，聽(tīng)閾判斷以P3波為主〔5〕。

1.5 掃描電鏡標(biāo)本制備 灌注后第1天測(cè)試完ABR閾值后，于麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物?？焖偃コ?tīng)泡周?chē)M織，暴露耳蝸后置于2.5%戊二醛固定液中，蝸尖鉆孔，用微量注射器緩慢注入2.5%戊二醛固定液，去除骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，4℃冰箱過(guò)夜，次日鋨酸后固定乙醇逐級(jí)脫水，臨界點(diǎn)干燥，鍍膜后掃描電鏡下觀察〔6〕。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ABR閾值檢測(cè) 用藥前各組ABR閾值無(wú)顯著差異；阿米卡星作用5 d后ABR閾值上升，與正常對(duì)照組差異顯著；聯(lián)合用藥組有輕度的ABR閾值恢復(fù)，但較正常閾值仍有差異。見(jiàn)表1。

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果 正常對(duì)照組耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞排列整齊，外毛細(xì)胞纖毛呈V形無(wú)脫落；阿米卡星組耳蝸底回部分外毛細(xì)胞出現(xiàn)散亂、倒伏、融合甚至缺失的現(xiàn)象，內(nèi)毛細(xì)胞邊緣出現(xiàn)球形物隆起；聯(lián)合用藥組內(nèi)、外毛細(xì)胞病理改變與阿米卡星組相比明顯減輕，提示刺五加注射液對(duì)阿米卡星作用下受損的毛細(xì)胞具有保護(hù)作用。見(jiàn)圖1。

組別用藥前用藥后正常對(duì)照組20 25±1 4521 15±1 54阿米卡星組24 24±1 3248 26±1 781)聯(lián)合用藥組23 86±1 2838 17±1 421)2)刺五加注射液組21 14±1 3521 56±1 38

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05；與阿米卡星組比較:2)P<0.05

圖1 各組耳蝸掃描電鏡結(jié)果(×3 500)

3 討 論

耳蝸結(jié)構(gòu)中的內(nèi)、外毛細(xì)胞是重要的感音細(xì)胞，在發(fā)育期由于藥物、噪音等因素的作用下所致毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷及數(shù)量減少將造成個(gè)體成年后發(fā)生不可逆的聽(tīng)覺(jué)障礙。AmAn作為一類在發(fā)展中國(guó)家廣泛使用的廣譜抗生素，具有性質(zhì)穩(wěn)定、殺菌力強(qiáng)、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，但其副作用耳毒性也不容忽視，嚴(yán)重限制其臨床使用。AmAn在內(nèi)耳的代謝特點(diǎn)、氧化應(yīng)激、金屬離子、毛細(xì)胞發(fā)生過(guò)度凋亡、線粒體功能失調(diào)等因素都與其耳毒性有關(guān)。AmAn中的阿米卡星有較強(qiáng)的耳毒性，能誘導(dǎo)毛細(xì)胞受損、甚至死亡來(lái)?yè)p害聽(tīng)力〔7,8〕。ABR對(duì)內(nèi)耳及中樞部位疾病的定位診斷具有重要的意義，目前被認(rèn)為是反映耳蝸聽(tīng)功能的有效客觀指標(biāo)之一。本研究證實(shí)阿米卡星損傷豚鼠聽(tīng)功能是通過(guò)其對(duì)毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量的破壞性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。AmAn在耳蝸內(nèi)大量積蓄從而導(dǎo)致耳蝸缺血、缺氧及大量自由基產(chǎn)生是其耳毒性產(chǎn)生的重要條件〔7,8〕。ASS可擴(kuò)張血管來(lái)增加局部血流量、減少自由基的生成、抑制促凋亡基因的過(guò)度表達(dá)〔2,9〕。此外，ASS還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、對(duì)抗輻射、腫瘤、炎癥及增加機(jī)體對(duì)損傷的耐受力等功能〔10,11〕。ASS對(duì)新生豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用與ASS的藥理作用有關(guān)，但確切機(jī)制還需研究。

1 賈琳琳，趙曉蓮，張建華,等.刺五加注射液對(duì)外源性谷氨酸所致豚鼠耳蝸復(fù)合動(dòng)作電位和內(nèi)耳組織形態(tài)的影響〔J〕.中成藥，2013；35(9)：2008-10.

2 賈琳琳，張 滌，李佳明,等.刺五加注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中谷氨酸及其受體表達(dá)的影響〔J〕.中成藥，2016；38(1)：181-2.

3 胡凌翔，吳 皓，石復(fù)辛.內(nèi)耳注射藥物建立新生鼠耳聾動(dòng)物模型〔J〕.聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2013；21(1)：61-5.

4 Mulders WH，Robertson D.Gentamicin abolishes all cochlear effects of electrical stimulation of the inferior colliculus〔J〕.Exp Brain Res，2006；174(1)：35-44.

5 Fetoni AR，Eramo SL，Rolesi R，etal.Antioxidant treatment with coenzyme Q-ter in prevention of gentamycin ototoxicity in an animal model〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Ital，2012；32(2)：103-10.

6 李勝利，朱宏亮，劉全征,等.復(fù)聰湯對(duì)工業(yè)噪聲所致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞修復(fù)再生的研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2013；28 (3)：811-8.

7 Kim YR，Kim MA，Cho HJ,etal.Galangin prevents aminoglycoside induced ototoxicity by decreasing mitochondrial production of reactive oxygen species in mouse cochlear cultures〔J〕.Toxicol Lett，2016；14(245)：78-85.

8 Dong Y，Liu D，Hu Y，etal.NaHS protects cochlear hair cells from gentamicin-induced ototoxicity by inhibiting the mitochondrial apoptosis pathway〔J〕.PLoS One,2015;10(8)：e0136051.

9 賈琳琳，湯 浩，齊淑芳,等.刺五加注射液拮抗慶大霉素所致豚鼠耳蝸血管紋細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中成藥，2012；34(4)：736-8.

10 王 黎，于小鳳，曲紹春,等.復(fù)方刺五加注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影響〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2007；32(2)：2174-6.

11 劉 宏.刺五加注射液治療腦卒中后抑郁及神經(jīng)功能缺損的療效觀察〔J〕.海南醫(yī)學(xué)，2008；19(1)：56-7.

〔2015-03-11修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.D201113)；佳木斯大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(No.Sz2010-004)

賈琳琳(1975-)，女，副教授，博士，主要從事中藥抗氨基苷類抗生素耳毒性機(jī)制研究。

鄒艷紅(1978-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中藥抗藥物耳毒性機(jī)制研究。

Q437

A

1005-9202(2016)24-6080-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.015

1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院