羅浩銘 王 穎 陳英紅 劉 達(dá) 張曉熒

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春 130117)

人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

羅浩銘 王 穎1陳英紅1劉 達(dá) 張曉熒2

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春 130117)

目的 探討不同組分人參糖蛋白對(duì)β-淀粉樣蛋白25～35(Aβ25～35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。方法 采用超濾、透析等方法分離得到人參糖蛋白P1,采用葡聚糖凝膠對(duì)P1分離純化得到P2和P3。采用苯酚-硫酸法測(cè)定3個(gè)組分中性糖含量，間羥基聯(lián)苯法測(cè)定中酸性糖含量，Lowry法測(cè)定蛋白含量，高效液相色譜法測(cè)定純度和分子量分布。采用MTT法考察人參糖蛋白對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)人參糖蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 P1中性糖含量為25.95%，酸性糖含量6.80%，蛋白含量為71.25%，重均分子量分布在700～45 000 D。P2中性糖含量為13.25%，酸性糖含量10.45%，蛋白含量為63.65%，重均分子量分布在4 500～20 000 D。P3蛋白含量為88.18%，重均分子量分布在5 000 D。組成糖和氨基酸分析結(jié)果：人參糖蛋白主要由甘露糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖及N-乙酰葡萄糖(或N-乙酰半乳糖)以及17種氨基酸。人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有抑制作用，其中P1作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度為 2.5 μg/ml時(shí)即表現(xiàn)出顯著抑制細(xì)胞凋亡活性(P<0.05)。結(jié)論 人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有抑制作用，可有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

人參糖蛋白；β-淀粉樣蛋白；SH-SY5Y；細(xì)胞凋亡

人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根及根莖，作為名貴中藥材，自古以來具有獨(dú)特的藥用價(jià)值和醫(yī)療保健作用〔1〕?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載，“人參主補(bǔ)五臟，安精神、定魂魄，止驚悸，除邪氣”，認(rèn)為其具有“明目、開心、益智”的功效。大量研究報(bào)道證實(shí)：人參中的皂苷類成分是其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的有效部位〔2～4〕。已有報(bào)道證實(shí)：人參中非皂苷成分具有改善記憶功能的生物活性〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)主要探討人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y凋亡的影響。

1 儀器與方法

1.1 藥品和試劑 人參、人參總皂苷(宏久生物科技股份有限公司)；葡萄糖、葡聚糖、半乳糖醛酸、Sephadex G15、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO、β淀粉樣蛋白25～35(Aβ25～35，Sigma)；DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Gibco)；小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒 Annexin V-FITC(美國BD公司)；濃硫酸、苯酚、間羥基聯(lián)苯、碳酸鈉、氫氧化鈉等試劑為分析純，均購自北京化工廠。

1.2 細(xì)胞 SH-SY5Y 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 儀器 754紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品)；高效液相色譜系統(tǒng),10AT-VP泵,示差折光檢測(cè)器(日本島津)；GPC軟件；IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)；多功能酶標(biāo)儀(GENE)；Mili Q超純水器(美國Millipore)；BC-J160S二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；SW-CJ-1F 超凈臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)LD5-2B(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；電子天平BSA224S(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；流式細(xì)胞儀Calibur(美國BD公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 人參糖蛋白的分離純化 取人參5 kg，粉碎成粗粉，加15倍量水煎煮2次，每次3 h，過濾，合并濾液。濾液濃縮至5 L，經(jīng)D101大孔吸附樹脂20 L水洗脫，洗脫液經(jīng)截留分子量30 kD的中空纖維柱超濾，超濾液濃縮，真空干燥，得人參水提取物。取人參水提物500 g，經(jīng)10 kD透析袋透析48 h，透析內(nèi)液冷凍干燥，得人參糖蛋白P1(收率)。取P1部分 200 g，加4 ml水溶解，經(jīng)中壓柱層析Sephadex G-15凝膠柱(柱長19 cm；內(nèi)徑3.5 cm)分離，洗脫液為pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)，得到P2和P3。

1.4.2 人參糖蛋白各組分含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定P1、P2、P3組分人參糖蛋白中性糖含量〔7〕；采用間羥基聯(lián)苯法，葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定P1、P2、P3組分人參糖蛋白酸性糖含量〔8〕；采用Lowry法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定P1、P2、P3組分人參糖蛋白含量〔9〕。

1.4.3 人參糖蛋白重均分子量的測(cè)定 采用高效液相色譜法(HPLC)，以牛血清蛋白(66 430 D)、細(xì)胞色素C(13 000 D)、蛋白酶抑制劑(6 500 D)、VB12(1 355.37 D)、L-色氨酸(204.23 D)為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品在相同色譜條件下的保留時(shí)間，利用GPC軟件，分別計(jì)算P1、P2、P3組分重均分子量。色譜條件：色譜柱：Sepax SRT SEC-100(Φ 7.8 mm×300 mm，5 μm)，截留分子量：100～100 000 D；流動(dòng)相：PBS(pH7.0)；流速：0.5 ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

1.4.4 組成糖分析 將樣品制備成1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生物，再以各單糖的PMP衍生物作為對(duì)照品，通過HPLC法分析其組成糖種類。儀器：高效液相色譜儀；色譜柱：Diamonsil-C18分析柱(Φ 4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A：PBS(pH6.8)：乙腈=85∶15(體積分?jǐn)?shù))；B：PBS(pH6.8)：乙腈=60∶40(體積分?jǐn)?shù))； 流速：0.9 ml/min；柱溫：40 ℃； 檢測(cè)波長：250 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

1.4.5 氨基酸分析 P1部分參照文獻(xiàn)〔10〕方法處理。色譜柱：Agilent 9 Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm)。流動(dòng)相：A：乙腈：水=55∶45(體積分?jǐn)?shù))；B：KH2PO4緩沖液(pH7.2)=30∶70(體積分?jǐn)?shù))；流速：1 ml/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：室溫。

1.4.6 SH-SY5Y的培養(yǎng)和藥物配置 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y復(fù)蘇后，于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境：37℃、飽和濕度、5 %CO2。每周更換培養(yǎng)基2～3次。觀察細(xì)胞生長情況，使用0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用不含血清培養(yǎng)液配制藥物P1、P2、P3和Pt(人參總皂苷)至終濃度為125、25、5、2.5 μg/ml。

1.4.7 Aβ25～35的老化 將Aβ25～35用超純水配制成濃度為500 μmol/L的溶液，37℃培養(yǎng)箱中放置7 d老化，分裝至EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.8 Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1.0×104的濃度接種至96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液100 μl，樣品孔加入Aβ25～35(終濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L)。每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h；加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板，2 000 r/min，離心10 min，小心吸去上清液，加入150 μl DMSO，充分溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定各孔OD值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 = (A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.4.9 人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù) 按1.4.8的方法操作接種96孔板，培養(yǎng)24 h，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液100 μl，樣品孔加入人參糖蛋白和人參總皂苷樣品(終濃度為5,25,125 μg/ml)及Aβ25～35；每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h，加入MTT，后續(xù)操作同1.4.8。測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Aβ25～35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 按1.4.8方法接種12孔板，培養(yǎng)24 h；棄去上清液，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液1.0 ml，樣品孔加入Aβ25～35(終濃度為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)，培養(yǎng)72 h；棄上清，加入預(yù)冷的PBS洗滌2次，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min 4℃離心10 min；棄上清，細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer，加入5 μl Annexin V-FITC試劑盒中的熒光試劑 FITC及5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，加入1 000 μl Binding Buffer。1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4.11 人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1.0×104的濃度接種至12孔板，每孔2.0 ml，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液，模型孔加入Aβ25～35(終濃度為10 μmol/L)，樣品孔分別加入P1、P2、P3和Pt(終濃度為 125、25、5、2.5 μg/ml)及Aβ25～35(終濃度為10 μmol/L)，培養(yǎng)72 h。胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，按1.4.10方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 人參糖蛋白的分離純化結(jié)果 經(jīng)凝膠柱分離，采用部分收集器收集洗脫液，隔管檢測(cè)。采用苯酚-濃硫酸法在490 nm處測(cè)定樣品吸光度，監(jiān)測(cè)樣品中糖含量；在280 nm處測(cè)定相同樣品吸光度，監(jiān)測(cè)樣品中蛋白、肽含量。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線，收集P2和P3部分，合并濃縮。結(jié)果見圖1。

圖1 Sephadex G-15凝膠柱洗脫曲線

2.2 人參糖蛋白各組分含量、組成糖、氨基酸分析結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)提取、分離、純化從人參中得到P1、P2、P3 3個(gè)組分，其中P1占人參藥材的0.45 %，P2和P3分別占P1的68.74%和28.56%。經(jīng)理化性質(zhì)研究表明，人參糖蛋白組分主要含有甘露糖(Man)、半乳糖(GalA)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖或N-乙酰半乳糖(GlcNAc或GalNAc)和17種氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蛋氨酸。見表1。

表1 P1、P2、P3理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)

各組分含量P1P2P3中性糖25 9513 25-酸性糖6 8010 45-蛋白71 2563 6588 18Man4 3810 97-Rha3．0019．004 12-GalA9 488 94-Glc51 3233 65-GlcNAc(GalNAc)15 9012 24-

2.3 人參糖蛋白重均分子量 采用HPLC法對(duì)P1、P2和P3分別進(jìn)行重均分子量的測(cè)定，結(jié)果P1為人參糖蛋白或肽的混合物，重均分子量分布在700～45 000 D；P2重均分子量分布在4 500～20 000 D；P3為人參蛋白類成分，重均分子量在5 000 D。見圖2。

2.4 人參糖蛋白拮抗Aβ25～35對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用 P1、P2、P3、Pt 4種樣品均可以有效逆轉(zhuǎn)Aβ25～35造成的細(xì)胞損傷，其中P1和P2不但可以拮抗Aβ25～35對(duì)細(xì)胞的損傷，還可以大幅度促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明P1、P2兩種組分對(duì)細(xì)胞具有較好的保護(hù)和促增殖活性。見表2。

圖2 GPC人參糖蛋白重均分子量分布圖

表2 人參糖蛋白拮抗Aβ25～35對(duì)細(xì)胞的抑制作用

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，表3同

2.5 Aβ25～35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)果 Aβ25～35可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Aβ25～35濃度(μmol/ml)分別為1.25、2.5、5、10、20時(shí)，細(xì)胞凋亡率(%)分別為(12.1±0.4)、(25.1±11.8)、(35.3±2.5)、(56.2±3.5)、(67.7±2.8)。在1.25～20 μmol/ml濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨Aβ25～35濃度升高而增加。當(dāng)Aβ25～35濃度為10 μmol/ml時(shí)，凋亡率約為 50%，因此選擇該濃度作為模型組藥物濃度。

2.6 人參糖蛋白對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞結(jié)果顯示，當(dāng)使用Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，Q2和Q4象限出現(xiàn)大量細(xì)胞群，說明細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且大量細(xì)胞已進(jìn)入晚期凋亡或成為壞死細(xì)胞。當(dāng)人參糖蛋白P1、P2、P3以及人參總皂苷Pt四種樣品和Aβ25～35共同孵育SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，Q2和Q4象限細(xì)胞數(shù)均有明顯減少的趨勢(shì)，說明4組樣品均對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的凋亡具有抑制作用。其中，以P1作用最強(qiáng)，當(dāng)最低濃度為 2.5 μg/ml即可顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見表3。

Aβ25?35濃度(μmol/ml)P1P2P3Pt1045 74±6 02 529 83±10 91)39 80±11 344 70±7 335 25±7 3527 08±10 11)29 95±9 71)34 87±5 937 90±5 52521 35±8 32)26 5±8 61)29 73±4 61)29 25±4 51)12520 66±7 82)25 94±9 31)22 33±6 92)25 50±2 51)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中采用葡聚糖凝膠Sephadex G15為填料對(duì)P1部分進(jìn)行分離純化，得到P2和P3部分。除此之外還考察了另外兩種常用的分離天然大分子化合物的填料，分別為Sephadex G10和Sepharose 4b結(jié)果表明，這兩種填料對(duì)P1部分的分離均一性不如Sephadex G15。因此，通過綜合比較分析，本實(shí)驗(yàn)采用Sephadex G15作為分離材料。

本實(shí)驗(yàn)中分離得到P1組分后，對(duì)其進(jìn)行了表征研究。發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用NaOH處理樣品后，其在280 nm下的吸光度從0.540上升到1.183。蘇氨酸含量從13.1 μg/mg降低到9.81 μg/mg，同時(shí)γ-氨基丁酸的量從0上升到了5.33 μg/mg。這說明P1組分中存在氧原子連接的糖肽鍵，可能在NaOH存在情況下發(fā)生了水解，得到新的物質(zhì)γ-氨基丁酸，進(jìn)而證實(shí)了P1組分中含有糖蛋白成分〔11〕。

從HPLC色譜圖中可以看出，P1組分包含至少6個(gè)峰，說明樣品并非是由單一成分構(gòu)成，而是由分子量范圍700～45 000 D的混合物構(gòu)成，平均分子質(zhì)量為16 000 D。在經(jīng)Sephadex G15分離純化后，得到的P2和P2部分，HPLC色譜圖中顯示這兩個(gè)組分的純度與P1相比明顯提高，通過理化性質(zhì)的測(cè)定分析，P2部分仍然由糖和氨基酸兩部分組成，其主要成分為人參糖蛋白，而P3部分則只有蛋白或肽成分。說明Sephadex G15分離效果較好，可以得到均一性較好的樣品組分。

在AD大腦中的Aβ可作為自由基的供體在過渡金屬離子催化誘導(dǎo)下產(chǎn)生過度的ROS，使其在細(xì)胞內(nèi)積蓄。ROS可與細(xì)胞膜上多種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng)促使脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流或從線粒體釋放，過多的細(xì)胞內(nèi)Ca2+使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)過度活化，從而導(dǎo)致NO自由基生成增加，導(dǎo)致一系列致炎細(xì)胞因子的釋放，致使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終表現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的缺失〔12，13〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)人參糖蛋白組分具有抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的生理活性，與人參糖蛋白組分平行，筆者們?cè)O(shè)計(jì)了相同劑量的人參總皂苷組(Pt)，結(jié)果表明其在促增殖和抗凋亡活性上均不如P1部分。P2和P3組分的活性均弱于P1，其中P3的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明其主要為人參蛋白或肽，提示人參蛋白可能具有協(xié)同糖蛋白，使其活性增強(qiáng)的作用。

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〔2016-10-11修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題(No:2015Q040)

張曉熒(1985-)，女，碩士，主管藥師，主要從事天然藥物大分子結(jié)構(gòu)及活性研究。

羅浩銘(1983-)，男，講師，主要從事天然藥物中大分子化合物結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究 。

R927.2

A

1005-9202(2016)24-6077-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.014

1 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院