李春穎 徐兆忠 李 菁 崔雅惠 崔 影 曲 嫻

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

下丘腦室旁核微量注射精氨酸血管加壓素對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

李春穎 徐兆忠1李 菁 崔雅惠1崔 影1曲 嫻

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的探討下丘腦室旁核(PVN)微量注射精氨酸血管加壓素(AVP)對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的影響及可能機(jī)制。方法 采用2-VD方法復(fù)制VD模型；2 w后PVN注射AVP，采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，用放射免疫分析測(cè)定AVP含量，用熒光分光光度法測(cè)去甲腎上腺素(NE)含量。結(jié)果 PVN注射AVP可以改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，海馬AVP及NE含量增多。結(jié)論 VD的發(fā)生可能與下丘腦釋放的AVP量減少導(dǎo)致大腦海馬內(nèi)AVP及NE含量減少有關(guān)。

血管性癡呆；下丘腦室旁核；精氨酸血管加壓素

血管性癡呆(VD)的發(fā)生與海馬有關(guān)〔1～3〕。實(shí)驗(yàn)表明下丘腦室旁核(PVN)對(duì)海馬有直接的神經(jīng)纖維聯(lián)系；順行示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海馬可直接投射到PVN〔4〕，在結(jié)構(gòu)上海馬與PVN之間存在往返神經(jīng)纖維聯(lián)系，是精氨酸血管加壓素(AVP)的重要作用靶點(diǎn)，同時(shí)海馬也可調(diào)節(jié)AVP分泌。損傷海馬和顯微注射發(fā)現(xiàn)AVP可作用于海馬齒狀回,影響PVN內(nèi)AVP mRNA的水平〔4〕。研究表明AVP具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、促進(jìn)回憶過(guò)程的生理效應(yīng)〔5〕。VD的發(fā)生是否通過(guò)PVN調(diào)節(jié)AVP釋放有關(guān)，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)PVN微量注射AVP觀察其能否改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 雄性健康SPF級(jí)Wistar大鼠，體重220～240 g，由吉林大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2007-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±1)℃，濕度40%～50%，光照、黑暗各12 h，光照時(shí)間為7：00～19：00。AVP注射液由百靈威科技有限公司提供。AVP放免試劑盒由北方試劑研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、假手術(shù)組、模型組、模型+腦脊液組、模型+AVP組(AVP組)，每組10只。正常組不作處理。假手術(shù)組：只分離頸總動(dòng)脈，套絲線扣，但不阻斷血流。模型組：制備模型。ACSF組：建模后下套管，2 w后注射ACSF(2.0 μl)，1次/d，連續(xù)7 d。AVP組：建模后下套管，2 w后注射AVP(600 ng，2.0 μl)，1次/d，連續(xù)7 d。所有大鼠均進(jìn)入最終結(jié)果分析。

1.3 動(dòng)物模型的制備及注射套管安放 選用雄性Wistar大鼠，采用2-VD方法制備VD模型。以10%水合氯醛(按0.35 ml/100 g體重)行腹腔麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)。腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg(用無(wú)菌蒸餾水溶解)后，動(dòng)脈夾夾閉CCA 10 min，再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，將大鼠固定于立體定位儀上，手術(shù)區(qū)皮膚消毒，按照大鼠腦立體定位圖譜，暴露顱骨，在PVN(前囟后-1.08 mm，中線旁左右旁開(kāi)0 mm，深度7.0 mm)安置不銹鋼導(dǎo)藥管，牙科粉固定于顱骨表面，術(shù)后腹腔注射抗生素。放回籠中保溫飼養(yǎng)。

1.4 微注射給藥方法 在清醒狀態(tài)下進(jìn)行注射，通過(guò)微量注射泵以0.2 μl/min的速度通過(guò)引導(dǎo)管向核團(tuán)內(nèi)各注射AVP或ACSF,留針2 min以防藥液流出。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完畢后用微量注射器注射滂胺天藍(lán)溶液0.2 μl，標(biāo)記微量注射下丘腦室旁核的位置。腹腔注射過(guò)量麻醉藥處死動(dòng)物，取腦置于40%甲醛溶液中固定1 d，第二天做冠狀切片鑒定下丘腦室旁核的位置。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 圓形水池(直徑80 cm)中放置一低于水面1 cm的平臺(tái)，并且平臺(tái)位置不能改變。水溫保持在(25±2)℃。安靜環(huán)境，實(shí)驗(yàn)總計(jì)進(jìn)行6 d，第1～5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，從東、南、西、北4個(gè)入水點(diǎn)將大鼠背對(duì)平臺(tái)輕輕地放入水池內(nèi)，同時(shí)開(kāi)始記錄，每次間隔30 s。從大鼠入水到找到平臺(tái)所需的時(shí)間即為大鼠找到平臺(tái)的潛伏期。將4次潛伏期時(shí)間的平均值作為每天大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，大鼠的潛伏期按120 s計(jì)算。于實(shí)驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，平臺(tái)撤出，從平臺(tái)的對(duì)角線將大鼠處放入水迷宮，記錄大鼠在平臺(tái)所在象限所用的時(shí)間即穿越有效區(qū)的時(shí)間和120 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.6 AVP含量 大鼠快速斷頭，取全腦，放入煮沸的生理鹽水，5 min后取出，用濾紙吸干附著的液體后，分離大腦皮層和海馬，分別稱重后加入1 mol/L HCl 1 ml，勻漿后倒入EP管中，室溫放置100 min，再加入1 mol/L NaOH 1 ml，4℃離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液，置-70℃冰箱保存待測(cè)。采用放射免疫分析法測(cè)定AVP含量。操作嚴(yán)格按藥盒說(shuō)明書進(jìn)行，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)本實(shí)際濃度。

1.7 NE含量 大鼠快速斷頭，取海馬，稱重，勻漿，用熒光分光光度法測(cè)NE含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，并使用GraphPad Prism 6軟件處理圖片。

2 結(jié) 果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 各組大鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加尋找平臺(tái)的潛伏期也明顯縮短。和正常組比，假手術(shù)組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期兩組間無(wú)顯著差異，模型組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均明顯的延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，ACSF組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期、穿越有效區(qū)時(shí)間以及穿越平臺(tái)的次數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與ACSF組大鼠比較，AVP組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組比較，假手術(shù)組大鼠穿越有效區(qū)時(shí)間以及穿越平臺(tái)的次數(shù)無(wú)顯著差異(P<0.05)，模型組大鼠穿越有效區(qū)時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)的次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較，ACSF組大鼠穿越有效區(qū)時(shí)間以及穿越平臺(tái)的次數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與ACSF組大鼠比較，AVP組大鼠穿越有效區(qū)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)的次數(shù)增多(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 大腦海馬內(nèi)AVP含量 與正常組大鼠比較，假手術(shù)組大鼠海馬內(nèi)AVP含量沒(méi)有顯著性差異，模型組大鼠AVP含量明顯減少；與模型組比較，ACSF組大鼠海馬內(nèi)AVP含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；與ACSF組比較，AVP組大鼠海馬內(nèi)AVP含量明顯高于ACSF組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 大腦海馬內(nèi)NE含量 與正常組大鼠比較，假手術(shù)組大鼠海馬內(nèi)NE含量無(wú)顯著性差異，模型組大鼠NE含量明顯減少；與模型組比較，ACSF組大鼠海馬內(nèi)NE含量差異無(wú)顯著性；與ACSF組比較，AVP組大鼠大海馬內(nèi)NE含量明顯高于ACSF組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

組別第1天第2天第3天第4天第5天正常組38±132±222±317±315±4假手術(shù)組33±229±425±419±414±2模型組60±11)56±41)43±31)36±31)33±51)ACSF組62±158±346±338±536±4AVP組45±12)42±22)35±42)29±42)20±32)

與正常組比較：1)P<0.05；與ACSF組比較：2)P<0.05，下表同

組別穿越有效區(qū)時(shí)間(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)AVP(pg/mg)NE(ng/g)正常組23±211±16 33±0 24755 22±18 18假手術(shù)組21±29±26 11±0 33814 53±28 69模型組10±11)4±11)1 99±0 291)508 67±29 351)ACSF組9±23±12 81±0 23530 67±30 17AVP組18±32)8±12)5 84±0 662)699 88±29 142)

3 討 論

目前實(shí)驗(yàn)室中反映動(dòng)物智力水平最可靠的指標(biāo)是學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮方法檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力。此實(shí)驗(yàn)主要檢查的是動(dòng)物的空間辨別能力，優(yōu)點(diǎn)是能夠排除糞便或尿液及所分泌的一些激素的影響，能夠使檢測(cè)結(jié)果更加可靠〔6〕。本研究提示，模型組及ACSF組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致〔7〕，注射AVP可改善這種狀況。AVP具有抗利尿、縮血管、加強(qiáng)記憶、參與體溫、維持晝夜節(jié)律及免疫調(diào)節(jié)等生理功能，同時(shí)還是學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)器，能夠加工信息，加強(qiáng)鞏固記憶和形成條件反射等〔8〕。腦內(nèi)有許多部位分布AVP受體，如海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核、下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)等〔9〕海馬結(jié)構(gòu)參與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)〔10〕，對(duì)缺血缺氧十分敏感〔11〕。海馬注射AVP可以改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力〔12〕。本實(shí)驗(yàn)提示，模型組及ACSF組海馬內(nèi)AVP含量明顯下降，而AVP組大鼠AVP含量增高。NE可能是通過(guò)抑制興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)及活性催化過(guò)程對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用的。研究表明全腦反復(fù)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)皮層和海馬NE含量都有不同程度降低〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組及ACSF組大腦皮質(zhì)及海馬NE含量明顯下降，而AVP組大鼠NE含量增高。綜上，反復(fù)缺血再灌注導(dǎo)致VD的發(fā)生，這可能與下丘腦釋放的AVP減少導(dǎo)致大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)AVP及NE含量減少有關(guān)，這些可能是造成VD模型大鼠發(fā)生學(xué)習(xí)記憶能力減退的原因。

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〔2015-03-18修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.2010Z102；2015Q033)；吉林省教育廳項(xiàng)目(No.2015168)

曲 嫻(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

李春穎(1981-)，女，講師，博士，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

R749.13

A

1005-9202(2016)24-6073-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.012

1 北華大學(xué)附屬醫(yī)院