李 升 黃玉珊 秦 翠

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 吉安 343009)

大黃素對脂多糖誘導(dǎo)單核細胞分泌白細胞介素-1β、白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的抑制作用

李 升 黃玉珊 秦 翠1

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 吉安 343009)

目的研究大黃素對內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細胞分泌白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的抑制作用。方法 采用人外周血分離培養(yǎng)單核細胞，25 μg/ml內(nèi)毒素作為刺激因子，觀察0.1，0.5，1，5，10，25 μg/ml 6種質(zhì)量濃度的大黃素對單核細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α活性的影響，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。結(jié)果 大黃素對內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β和TNF-α均有一定影響，大黃素濃度在0.5～10 μg/ml可顯著抑制LPS誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β，并在1 μg/ml時達到最大抑制作用；大黃素在較低濃度時(0.1，0.5 μg/ml)對單核細胞分泌TNF-α具有顯著抑制作用，但當(dāng)濃度升高時，抑制作用減弱。大黃素對內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-6沒有明顯影響。結(jié)論 大黃素在一定濃度范圍內(nèi)對內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β及TNF-α均有顯著抑制作用，這可能是大黃素治療牙周炎的機制之一。

大黃素；牙周炎；內(nèi)毒素；白細胞介素(IL)；腫瘤壞死因子(TNF)-α；單核細胞

大黃素作為中藥大黃的有效成分，動物實驗已經(jīng)證實大黃素能阻斷細菌脂多糖(LPS)對牙周組織的損害〔1〕，但具體作用機制尚未明確。而在牙周病的發(fā)病機制當(dāng)中，LPS除直接對靶細胞的毒性作用外，還能刺激單核細胞誘生白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子，對炎癥反應(yīng)起重要作用，與牙周病變的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，本文探討大黃素對LPS誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 大黃素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；100 ml新鮮抗凝全血(南京市血液中心)；淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；Hanks液及RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(FuMeng Gene公司)；LPS(南京大學(xué)生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點實驗室惠贈)；人IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物)。 洗板機(BIO-RAD公司，1575型)；酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司，ELX800型)。

1.2 單核細胞的分離培養(yǎng)〔2〕取新鮮抗凝全血100 ml，用Hanks液按1∶1體積比稀釋后，以人淋巴細胞分離液按說明書操作進行梯度密度離心分離，懸于含10%胎牛血清及雙抗(青、鏈霉素各100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液中，使用細胞計數(shù)板調(diào)整細胞密度至2×106/ml。將上述細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3 h，鏡檢確定細胞貼壁后，輕輕換去培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液后即得單核細胞用于實驗，臺盼藍染色確定細胞活力>95%。

1.3 藥物干預(yù) 將上述貼壁細胞用細胞刷處理，懸于RPMI1640培養(yǎng)液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml細胞，每組4個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h貼壁后，棄原培養(yǎng)液，清洗2次后加藥。分組如下：空白對照組(不加任何藥物)，LPS組，LPS+大黃素組(大黃素終濃度分別為：0.1、0.5、1、5、10、25 μg/ml)，LPS+地塞米松組(地塞米松終濃度為2 μg/ml)，所有組中LPS終濃度均為25 μg/ml。

1.4 細胞因子濃度測定 培養(yǎng)48 h后，吸取培養(yǎng)液上清，根據(jù)試劑盒說明采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各細胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組IL-1β濃度 當(dāng)大黃素的濃度達到0.5 μg/ml時，可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β，其抑制作用在濃度為1 μg/ml時達到最大效應(yīng)(54.5%)，當(dāng)濃度超過1 μg/ml時抑制作用逐漸減弱，達到25 μg/ml時，抑制作用與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2 各組IL-6濃度比較 大黃素對IL-6的分泌沒有明顯抑制作用，各組的IL-6濃度與LPS組相比均無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.3 各組TNF-α濃度 大黃素在較低濃度時(0.1、0.5 μg/ml)時對LPS誘導(dǎo)單核細胞分泌TNF-α具有顯著抑制作用(P<0.05)，當(dāng)大黃素濃度升高時抑制作用減弱(P>0.05)，見表1。

組別IL?1β(ng/ml)IL?1β抑制作用(%)IL?6(ng/ml)TNF?α(ng/ml)TNF?α抑制作用(%)空白對照組1 07±0 31-1 31±0 441 31±0 44-LPS組1 98±0 0401 72±0 222 70±0 400LPS+0 1μg/ml大黃素組1 74±0 3012 11 67±0 181 16±0 181)57 0LPS+0 5μg/ml大黃素組1 39±0 051)29 81 65±0 341 10±0 211)59 3LPS+1μg/ml大黃素組0 90±0 081)54 51 73±0 251 67±0 2038 1LPS+5μg/ml大黃素組1 43±0 021)27 81 69±0 372 10±0 4722 2LPS+10μg/ml大黃素組1 81±0 061)8 61 82±0 412 52±0 446 7LPS+25μg/ml大黃素組1 92±0 043 01 74±0 382 49±0 417 8LPS+2μg/ml地塞米松組0 53±0 3273 20 91±0 220 51±0 1181 1

與LPS組比較：1)P<0.05

3 討 論

大黃素是中藥大黃的有效成分之一，目前的研究認為大黃具有一系列的藥理作用，包括抗厭氧菌作用；免疫調(diào)節(jié)作用；清除氧自由基；對細胞的保護作用等〔3〕，對其在牙周病防治中的作用目前提出的主要觀點有：大黃素能阻斷內(nèi)毒素對人牙周膜細胞的毒性作用〔4〕；大黃素可抑制牙周附著喪失和牙槽骨吸收，并能促進牙槽骨形成〔5〕；能阻斷LPS對動物牙周組織的損害〔1〕。細菌作為牙周炎的始動因子，其LPS是重要的致病因素，其激發(fā)的宿主反應(yīng)是造成牙周組織破壞的主要原因。LPS是誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α的強刺激劑，而IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，IL-1β能直接趨化激活中性粒細胞、粒細胞及肥大細胞等在牙周組織的聚集和浸潤，并釋放前列腺素、白三烯B4等多種酶和炎癥介質(zhì)，參與牙周炎的形成，也可通過介導(dǎo)牙周組織中的非炎癥細胞如成纖維細胞、破骨細胞的功能活動，使其合成和分泌一系列酶及前列腺素等，引起基質(zhì)降解、結(jié)締組織喪失和骨破壞。IL-6能活化破骨細胞，促進骨吸收，參與局部炎癥反應(yīng)和牙周組織破壞。TNF-α是一種強烈的骨吸收因子，能通過增加破骨細胞數(shù)量、減少骨基質(zhì)鈣化而引起骨吸收。因此，有學(xué)者〔6〕提出，IL-1β、IL-6和TNF-α作為炎癥和骨吸收介質(zhì)，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，有可能成為牙周炎診斷的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素在一定濃度范圍內(nèi)對LPS誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-1β及TNF-α均有顯著抑制作用，這可能是大黃素治療牙周炎的機制之一，其中具體抑制作用機制，還有待進一步研究。

1 楊明華,張東生,陳湘華,等.大黃素抑制脂多糖誘導(dǎo)動物性牙周炎的組織學(xué)研究〔J〕.江蘇醫(yī)藥雜志,2002；28(9):659-61.

2 薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)〔M〕.北京:科學(xué)技術(shù)出版社,2001：590-3.

3 楊明華,俞未一.中藥大黃在牙周病防治中的應(yīng)用前景〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究,2005；21(1):101-2.

4 楊明華,俞未一.大黃抑制內(nèi)毒素對牙周膜細胞作用的研究〔J〕.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2004；20(3):148-50.

5 劉 冰,李淑娟,楊冬茹,等.大黃素治療實驗性牙周炎的骨計量學(xué)研究〔J〕.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010；26(5):593-6.

6 耿衛(wèi)艷,譚穎徽,施生根,等.重度牙周炎病人非刺激性全唾液中IL-6和TNF-α檢測〔J〕.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2009；19(5):268-70.

〔2015-04-22修回〕

(編輯 馮 超/曹夢園)

吉安市指導(dǎo)性科技計劃項目(吉市科計字〔2014〕4號)

李 升(1983-)，男，碩士，講師，主要從事循證口腔醫(yī)學(xué)研究。

R781

A

1005-9202(2016)24-6069-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.010

1 潛江市中心醫(yī)院口腔科