徐向青 孫靈芝 徐向東 吳宏赟

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

藥對(duì)刺五加-梔子對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠GSα-PKA-cAMP信號(hào)通路的影響

徐向青 孫靈芝 徐向東 吳宏赟

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

目的探討藥對(duì)刺五加-梔子對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激模型大鼠GSα-PKA-cAMP信號(hào)通路的影響及其抗抑郁機(jī)制。方法 健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥對(duì)刺五加-梔子組，每組10只。采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激方法建立抑郁模型。采用RT-PCR法檢測(cè)GSα蛋白的表達(dá)；采用ELISA法檢測(cè)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶(PKA)的變化。結(jié)果 給藥4 w后，與空白組相比，模型組GSα蛋白表達(dá)和cAMP含量及PKA活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組相比，藥對(duì)刺五加-梔子組上述指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論 藥對(duì)刺五加-梔子通過(guò)調(diào)節(jié)CUMS大鼠的海馬、前額葉皮層中GSα、PKA、cAMP含量，從而調(diào)節(jié)GSα-PKA-cAMP信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。

藥對(duì)； 刺五加-梔子； GSα蛋白；環(huán)磷酸腺苷；蛋白激酶

抑郁癥除心境低落外，尚表現(xiàn)為興趣喪失、認(rèn)知功能障礙、意志活動(dòng)減退、自我評(píng)價(jià)低、精神運(yùn)動(dòng)遲滯、性欲減退、睡眠障礙、焦慮激越等〔1，2〕。這些癥狀與肝郁有別，而具有“志衰不寧”的特點(diǎn)。腎主水藏志、心主火藏神，水火不能交濟(jì)，神不能寧，是導(dǎo)致上述癥狀的主要原因。本課題組基于“瀉南補(bǔ)北”的中醫(yī)傳統(tǒng)治法，采用藥對(duì)梔子-刺五加治療抑郁癥，取得了較好的療效〔3〕。本次研究采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激的方法，研究藥對(duì)刺五加-梔子對(duì)抑郁癥模型大鼠海馬、額葉皮質(zhì)GSα環(huán)磷酸腺苷(AMP)-蛋白激酶(PKA)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，探討其抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠40只，雄性，二級(jí)，5～6個(gè)月齡，體重(180±20)g，北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖公司提供〔合格證編號(hào)：SCXK(京)2011-0004〕。

1.2 試劑 氟西汀(禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：2061A)；梔子、刺五加(由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara公司)，PCR試劑(羅氏公司)。PCR引物：上海生工生物技術(shù)有限公司合成； DEPC處理水(Solarbio)、cAMP酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒、 PKA ELISA檢測(cè)試劑盒，Assay公司分裝產(chǎn)品。

1.3 器材 大鼠敞箱(自制)；Morris水迷宮箱(吉量軟件科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop-2000)，PCR儀(美國(guó)羅氏480公司)，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Ampharmacia公司)，美國(guó)ABI Veriti 96孔型梯度PCR儀；勻漿器(美國(guó)IKA公司)，電子分析天平(德國(guó)賽多利斯ME235p)，低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(德國(guó)DT5-3型)，Elx808型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，洗板機(jī)(美國(guó)BioTek公司Elx50型)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與給藥 SD大鼠40只，隨機(jī)分為四組，每組10只。①空白組：正常飼養(yǎng)；②模型組：按照慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激方法制備抑郁模型；③陽(yáng)性對(duì)照組：抑郁模型+氟西汀，氟西汀用0.9%生理鹽水配置(1.8 mg·kg-1·d-1)；④刺五加-梔子組：抑郁模型+藥對(duì)刺五加-梔子(2.16 g·kg-1·d-1)。完成造模后連續(xù)灌胃給藥 28 d?？瞻捉M和模型組以同樣方法灌胃等體積的生理鹽水。

1.4.2 慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激大鼠模型 建立抑郁大鼠模型，即接受21 d的慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激，包括禁食24 h 3次、禁水24 h 3次、通宵照明3次、4℃冰水游泳3次、45℃烘箱熱刺激3次、3次夾尾、3次高速水平振蕩。每天隨機(jī)安排1種，每種刺激至少出現(xiàn)3次。慢性應(yīng)激同時(shí)，除空白組外，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、刺五加-梔子組大鼠孤養(yǎng)1只/籠。

1.4.3 GSα蛋白含量的變化 各組取10只大鼠，行為學(xué)測(cè)試后將大鼠斷頭處死，在冰上剝離大腦，取額葉皮層、海馬置于Ep管，保存于-70℃冰箱。按照Trizol試劑要求，采用一步法分別提取額葉皮層、海馬總RNA。取100 mg組織加1 ml Trizol，4℃勻漿破碎樣品，室溫放置10 min，加入0.2 ml氯仿，劇烈振搖15 s，室溫放置3 min，4℃離心(12 000 r/min)15 min，取水相移入新EP管，加等量異丙醇，室溫10 min。4℃離心(15 000 r/min)15 min，棄上清，加75%乙醇1 ml洗滌，4℃離心(15 000 r/min)15 min，棄乙醇。重復(fù)洗滌1次，棄上清。取2 μl RNA產(chǎn)物在NanoDrop-2000紫外分光光度計(jì)上測(cè)濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0，說(shuō)明提取的總RNA純度較好。PCR引物：基因引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積20 μl，含PCR Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster 10 μl，cDNA 2 μl，無(wú)RNA酶水6 μl，上游與下游引物各1 μl。RT-PCR循環(huán)參數(shù)：預(yù)孵育95℃，5 min；擴(kuò)增95℃，10 s，58℃，15 s，72℃，15 s，45個(gè)循環(huán)；95℃，5 s，65℃，1 min；40℃，10 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)：3次。引物序列，見(jiàn)表1。

1.4.4 cAMP-PKA含量的變化 末次給藥后1 h，將大鼠斷頭處死，置于冰上迅速剝離大腦，分離額葉皮質(zhì)、海馬放入凍存管，置于液氮中，儲(chǔ)存于低溫冰箱-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA法檢測(cè)海馬和前額葉皮層組織中cAMP及PKA的含量。在96孔板上設(shè)定空白孔、待測(cè)孔及標(biāo)準(zhǔn)孔?？瞻卓撞患尤魏螛悠?，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，待測(cè)孔加入樣本40 μl，加入抗體10 μl，依序加生物素化抗體工作液每孔50 μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩搖勻，37℃×60 min；洗板，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，37℃×10 s，重復(fù)5次；顯色，顯色底物每孔100 μl，37℃×10 min；依序加入終止液每孔50 μl。檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm時(shí)的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算海馬和前額葉皮層組織中cAMP及PKA的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行Dunnettt檢驗(yàn)。

表1 引物序列

引物序列(5＇?3＇)GSα上游GCTCAACGACTCTGCCAAATGSα下游TGAAGTGGGTTTCTACGATGCβ?actin上游AGCGAGCATCCCCCAAAGTTβ?actin下游GGGCACGAAGGCTCATCATT

2 結(jié) 果

2.1 海馬和前額葉皮層組織GSα含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，藥對(duì)刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量明顯升高(P<0.01)，藥對(duì)刺五加-梔子組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

組別皮層海馬空白組1 02±0 211 02±0 22模型組0 55±0 111)0 55±0 181)陽(yáng)性對(duì)照組1 07±0 252)1 03±0 132)刺五加?梔子組1 07±0 182)1 17±0 202)

與空白組相比：1)P<0.01；與模型組相比：2)P<0.01；下表同

2.2 海馬和前額葉皮層組織PKA含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，藥對(duì)刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量明顯升高(P<0.01)。藥對(duì)刺五加-梔子組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 海馬和前額葉皮層組織cAMP含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經(jīng)藥物治療后，藥對(duì)刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量明顯升高(P<0.01)。藥對(duì)刺五加-梔子組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

組別額葉海馬空白組9 74±0 799 07±0 95模型組6 65±0 991)5 97±1 091)陽(yáng)性對(duì)照組9 71±1 122)9 14±1 602)刺五加?梔子組9 77±0 892)9 35±0 802)

組別額葉海馬空白組36 64±4 2734 20±3 78模型組17 57±2 501)16 27±3 411)陽(yáng)性對(duì)照組36 17±5 292)35 44±5 072)刺五加梔子組36 39±4 282)35 87±4 272)

3 討 論

慢性應(yīng)激模型是經(jīng)典的抑郁動(dòng)物模型，造模大鼠出現(xiàn)的抑郁行為與人類抑郁癥臨床表現(xiàn)類似，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的核心癥狀能被藥物改善〔4～7〕。藥對(duì)刺五加-梔子具有益腎水、清心火的功效，從現(xiàn)代中藥藥理學(xué)角度看，梔子具有抗焦慮、改善學(xué)習(xí)記憶、中樞抗炎、神經(jīng)元保護(hù)等作用。刺五加具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫增強(qiáng)作用，具有較強(qiáng)的神經(jīng)元保護(hù)作用，能提高體外神經(jīng)細(xì)胞存活率。

受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究抑郁癥發(fā)病機(jī)理的熱點(diǎn)所在，G蛋白在信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起廣泛和重要的整合、調(diào)節(jié)及放大作用，G蛋白耦聯(lián)的信號(hào)通路是抑郁癥研究的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔8〕。GSα-PKA-cAMP信號(hào)系統(tǒng)是當(dāng)前研究較為完善的受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。cAMP是目前最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信使，通過(guò)加強(qiáng)G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶(AC)耦聯(lián)，催化ATP水解生成細(xì)胞內(nèi)的第二信使cAMP。很多研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)、激素的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、基因表達(dá)以及細(xì)胞的增殖和分化均與cAMP有關(guān)。cAMP作為第二信使，進(jìn)一步激活PKA，尤其是抗抑郁藥物對(duì)抑郁癥的慢性治療過(guò)程中，增強(qiáng)大腦特定部位PKA的活性〔9〕。PKA可以將多種靶蛋白(如細(xì)胞骨架蛋白、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子等)磷酸化并調(diào)節(jié)其活性，其中磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，能夠調(diào)節(jié)多種基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)發(fā)育、生長(zhǎng)、興奮、凋亡、細(xì)胞修復(fù)及突觸形成等多個(gè)過(guò)程，影響個(gè)體及整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的基因表達(dá)，對(duì)受損傷腦組織神經(jīng)元的修復(fù)與存活也是至關(guān)重要的。

大量研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的慢性應(yīng)激可使大鼠出現(xiàn)抑郁表現(xiàn)〔10，11〕，同時(shí)，海馬中GSα-PKA-cAMP通路下調(diào)：cAMP水平降低、PKA含量下降、CREB mRNA及P-CREB表達(dá)下降。經(jīng)過(guò)抗抑郁藥物治療后，G蛋白中GSα與AC的耦合作用增強(qiáng)，該耦合作用的增強(qiáng)引起不同類型的抗抑郁藥物集中于AC對(duì)抑郁癥的治療作用增強(qiáng)。提示，GSα-PKA-cAMP信號(hào)通路是抗抑郁治療的靶點(diǎn)之一。

本研究結(jié)果顯示模型組大鼠額葉皮質(zhì)與海馬區(qū)GSα、PKA、cAMP表達(dá)顯著減少，提示抑郁癥的發(fā)生可能與GSα-PKA-CAMP信號(hào)通路的變化有關(guān)。緊張、恐懼、抑郁等心理應(yīng)激能夠?qū)е麓笫笊窠?jīng)細(xì)胞信號(hào)通路失衡并出現(xiàn)抑郁樣行為，如GSα、PKA、cAMP含量降低等，從而加重神經(jīng)元損傷。與模型組相比，藥對(duì)刺五加-梔子治療后大鼠額葉皮層與海馬區(qū)GSα、PKA、cAMP表達(dá)顯著升高，表明藥對(duì)刺五加-梔子能明顯提高大鼠額葉皮層與海馬區(qū)GSα、PKA、cAMP的表達(dá)。

綜上所述，前期研究證實(shí)藥對(duì)刺五加-梔子有明顯抗抑郁治療作用，其抗抑郁作用機(jī)制可能與GSα-PKA-cAMP信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81302956)

孫靈芝(1972-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

徐向青(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

R28

A

1005-9202(2016)24-6063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.007