陳 東 廖 偉

(贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

胰升糖素樣肽-1受體激活對高糖誘導(dǎo)心肌肥大的抑制作用及其機(jī)制

陳 東 廖 偉1

(贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

目的探討胰升糖素樣肽(GLP)-1受體激活對高糖誘導(dǎo)心肌肥大的抑制作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組(N組)，高糖組(H組)，高糖+Exendin-4組(E組)。干預(yù)48 h后采用Western 印跡法分別檢測各組細(xì)胞中心納素(ANP)、β-組織相容性復(fù)合體(MHC)、GLP-1、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、骨橋蛋白(OPN)表達(dá)情況。結(jié)果 高糖組ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增高；Exendin-4干預(yù)后ANP、β-MHC、TGF-β1、OPN蛋白表達(dá)降低，但仍高于正常對照組。高糖組GLP-1蛋白表達(dá)較正常對照組明顯降低，Exendin-4干預(yù)后GLP-1蛋白表達(dá)增加，但仍低于正常對照組。結(jié)論 GLP-1受體激活可能是通過激活GLP受體，抑制TGF-β1、OPN的表達(dá)，從而在抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中起重要作用。

胰升糖素樣肽；高糖；心肌肥大；骨橋蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子β

胰升糖素樣肽-1(GLP-1)是一種由腸黏膜L細(xì)胞分泌的腸促胰島素，不僅具有改善血糖控制的生理功能，還具有抗心肌細(xì)胞肥大、凋亡和抗纖維化的作用〔1〕。糖尿病心肌病的主要病理特征是心肌細(xì)胞肥大以及心肌間質(zhì)纖維增生。研究證實高血糖和高胰島素是促進(jìn)心肌肥厚的獨(dú)立因素〔2〕，高糖可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大。本研究探討GLP-1受體激動劑Exendin-4對高糖誘導(dǎo)心肌肥大的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。β-組織相容性復(fù)合體(β-MHC)抗體購自abcom公司；心納素(ANP)、GLP-1、辣根過氧化物酶抗體、HRP 標(biāo)記的辣根過氧化酶二抗購自ABclonal公司；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體購自Bioss公司；β-actin抗體購自中山金橋公司。Exendin-4購自Sigma公司。胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。DMEM、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMSO、RIPA 裂解液購自索萊寶公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液購自天根公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，隔天換液1次，待細(xì)胞長至約占培養(yǎng)皿90%時，用PBS沖洗兩遍，加數(shù)滴0.25%胰酶，消化1～2 min，加含血清培養(yǎng)液終止消化，用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞脫落，離心、重懸后按1傳3的比例分到新皿。

1.2.2 實驗分組 取狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代進(jìn)行實驗分組，隨機(jī)分為以下三組：①正常對照組(N組)：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；②高糖組(H組)：葡萄糖濃度為25.0 mmol/L；③高糖+Exendin-4(E組)：Exendin-4終濃度為50 nmol/L，葡萄糖濃度為25.0 mmol/L。48 h后行下一步實驗。

1.2.3 心肌細(xì)胞表面積測定 干預(yù)實驗結(jié)束后，取各組心肌細(xì)胞進(jìn)行圖像采集，采用Image-Pro Plus軟件分析各組心肌細(xì)胞表面積，每組隨機(jī)取10個視野，每個視野測定10個細(xì)胞表面積，以正常對照組為參照，計算各組細(xì)胞相對表面積。每組重復(fù)5次。

1.2.4 心肌細(xì)胞蛋白含量檢測 將培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞用PBS沖洗后，加入RIPA 裂解緩沖液，4℃，15 min 后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，4℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，在570 nm波長處檢測A值，計算單個心肌細(xì)胞蛋白含量(pg/cell)，每組重復(fù)5次。

1.2.5 Western印跡檢測各蛋白水平 取藥物處理48 h后的心肌細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞并提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，調(diào)整各組蛋白濃度至相同水平，各組取30～50 μg蛋白，進(jìn)行十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，孵育以相應(yīng)的一抗4℃過夜〔β-actin、ANP 1∶1 000；GLP-1、骨橋蛋白(OPN)、TGF-β 1∶400〕。孵育過夜后用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，而后加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗于室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜，使用ECL發(fā)光并將膜置于暗盒內(nèi)，壓上X光片，在暗室內(nèi)曝光、顯影、漂洗、定影，晾干后對膠片進(jìn)行拍照，使用Image J軟件進(jìn)行積分光密度分析。結(jié)果以β-actin 為內(nèi)參，計算各組各蛋白的相對表達(dá)量。每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 GLP-1受體激動劑對高糖誘導(dǎo)心肌肥大的抑制作用 與正常對照組〔心肌細(xì)胞表面積(661.84±35.46)μm2/cell,心肌細(xì)胞蛋白含量(650.84±44.31)pg/cell,ANP(0.997±0.104)、β-MHC(0.491±0.185)〕相比，高糖組心肌細(xì)胞表面積〔(959.88±39.86)μm2/cell〕、心肌細(xì)胞蛋白含量〔(948.90±62.05)pg/cell〕及ANP(1.581±0.185)、β-MHC(0.977±0.138)均明顯增加(P<0.05)。與高糖組相比，Exendin-4 處理48 h后明顯減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ANP(1.155±0.107)、β-MHC(0.758±0.173)的表達(dá)水平(P<0.01)和心肌細(xì)胞相對表面積〔(792.22±53.72)μm2/cell〕(P<0.01)及蛋白含量〔(750.14±48.34)pg/cell〕(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌細(xì)胞中ANP和β-MHC蛋白表達(dá)水平

圖2 各組心肌細(xì)胞中GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表達(dá)水平

2.2 GLP-1受體激動劑對高糖誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞GLP-1、TGF-β1和OPN蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比〔TGF-β1:(0.710±0.212),OPN:(0.412±0.195),GLP-1:(2.642±0.102)〕，高糖組TGF-β1(1.178±0.163)和OPN(1.002±0.131)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，GLP-1蛋白(0.770±0.147)表達(dá)降低(P<0.05)。Exendin-4干預(yù)可抑制TGF-β1(0.851±0.112)和OPN蛋白(0.857±0.168)的表達(dá)(P<0.01)，上調(diào)GLP-1蛋白(1.361±0.118)表達(dá)(P<0.05)。見圖2。3 討 論

心肌肥大是糖尿病心肌病的突出特征，而高血糖是誘導(dǎo)糖尿病性心肌肥大的主要因素之一〔3〕。本實驗表明Exendin-4干預(yù)后能減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的表達(dá)、心肌細(xì)胞蛋白含量及細(xì)胞面積，表明Exendin-4能抑制心肌肥大。目前認(rèn)為，糖尿病心肌病心肌纖維化主要因素可能是高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活以及TGF-β1表達(dá)增加等〔4〕。本研究提示TGF-β1/OPN信號通路參與心肌肥大過程。TGF-β1在心血管系統(tǒng)中表達(dá)廣泛，能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心臟成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，引起心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)纖維化。OPN是一種分泌型磷酸化的糖蛋白，屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，又是一種具有促炎及促纖維化特性等多功能的細(xì)胞因子，可與多種配體相結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。正常情況下，心臟OPN表達(dá)水平較低，然而在許多病理情況下，如急性心肌梗死后及慢性壓力負(fù)荷下小鼠心肌細(xì)胞OPN表達(dá)增強(qiáng)；在心肌肥大時OPN 在心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)〔5〕。隨著糖尿病心肌病和心衰病程的進(jìn)展，OPN的表達(dá)也明顯增多〔6〕。Subramania等〔7〕的研究顯示糖尿病小鼠心肌組織OPN表達(dá)增加，纖維化程度明顯，而敲除OPN基因后，心肌纖維化減輕，凋亡減少，心功能也得到了改善。這些報道與本實驗高糖誘導(dǎo)心肌肥大后OPN的表達(dá)增多結(jié)果相一致，說明OPN參與了高糖誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程。研究〔8〕發(fā)現(xiàn)OPN基因的啟動子有TGF-β的結(jié)合元件，提示OPN

可受TGF-β的調(diào)控。也有文獻(xiàn)報道TGF-β1下游信號蛋白Smad3 與OPN 基因啟動子結(jié)合，Smad4 與阻遏蛋白結(jié)合并使之移位，從而促使OPN mRNA轉(zhuǎn)錄，OPN 可能是TGF-β1 的下游分子〔9〕。在大鼠腎上皮細(xì)胞系NRK52E的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可上調(diào)OPN基因轉(zhuǎn)錄〔10〕。在人肝星狀細(xì)胞系中TGF-β1通過其下游Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)作用于OPN 啟動子區(qū)域促進(jìn)OPN表達(dá)〔11〕。另有報道提示，在哮喘和成骨細(xì)胞分化等病理生理過程，OPN都與TGF-β1通路密切相關(guān)。但是，也有研究〔12〕顯示OPN具有調(diào)節(jié)TGF-β1 激活作用。

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〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81360030)

廖 偉(1965-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事代謝性疾病研究。

陳 東(1990-)，男，在讀碩士，主要從事代謝性疾病研究。

R542

A

1005-9202(2016)24-6061-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.006

1 贛州市衛(wèi)計委