石 磊 彭 翔 趙 炎 徐治強(qiáng)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市普愛醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430034)

硫化氫對(duì)大鼠腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響

石 磊 彭 翔 趙 炎 徐治強(qiáng)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市普愛醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430034)

目的 探討硫化氫(H2S)對(duì)大鼠腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法 將75只350～400 g SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和H2S組，每組25只。模型組、H2S組大鼠行自體血腦內(nèi)注入法建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ停瑢?duì)照組僅行頭皮正中切口及暴露前囟而不行注射，H2S組于手術(shù)當(dāng)日開始每日腹腔注射硫氫化鈉10 mg/kg，連續(xù)28 d，其余兩組僅腹腔注射等體積生理鹽水。分別于術(shù)后4、7、14、28 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分及后肢運(yùn)動(dòng)功能Tarlov評(píng)分，術(shù)后14、28 d收集腦血腫周圍組織進(jìn)行CD34免疫組化染色以計(jì)算微血管密度及血管場(chǎng)面積，分別采用免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)術(shù)后4、7、14、28 d的血腫周圍組織神經(jīng)生長相關(guān)蛋白(GAP)-43和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平。結(jié)果 對(duì)照組術(shù)后4、7、14、28 d的神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分及后肢運(yùn)動(dòng)功能Tarlov評(píng)分分別為0分和5分，提示神經(jīng)功能和后肢運(yùn)動(dòng)功能正常。與對(duì)照組相比，模型組的神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分均升高，而Tarlov評(píng)分、血腫周圍微血管密度和血管場(chǎng)面積及血腫周圍組織VEGF水平和GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)；腦血腫大鼠經(jīng)H2S治療后以上指標(biāo)獲改善，如H2S組的神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分低于模型組，Tarlov評(píng)分、血腫周圍微血管密度和血管場(chǎng)面積及血腫周圍組織VEGF水平和GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)均高于模型組(P<0.05)，但H2S組以上指標(biāo)與對(duì)照組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 H2S可促進(jìn)大鼠腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)，可能與其增加腦血腫周圍組織VEGF水平及促進(jìn)GAP-43表達(dá)有關(guān)。

硫化氫；腦血腫；血管新生；神經(jīng)功能恢復(fù)

腦出血后形成的血腫壓迫及血腫分解的毒物是造成腦組織損傷的主要原因，而局部血管新生、微血管系統(tǒng)重建及神經(jīng)元再生是改善預(yù)后的關(guān)鍵〔1，2〕。硫化氫(H2S)參與了多個(gè)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞，被認(rèn)為是繼NO和CO后第3類內(nèi)源性氣體信號(hào)分子〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)H2S具有促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)的作用〔4,5〕，同時(shí)可通過KDR/mTOR/miR-640/HIF1α途徑促進(jìn)血管新生〔6〕。以上提示H2S可能對(duì)腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)有一定的作用，但目前尚不清楚。本研究采用行為學(xué)評(píng)價(jià)及分子生物學(xué)手段研究H2S對(duì)大鼠腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，兔抗鼠CD34單克隆抗體購自博奧森公司，兔抗神經(jīng)生長相關(guān)蛋白(GAP)-43抗體購自美國Abcam公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程公司。儀器：Model 550型酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司，BX51型顯微圖像采集系統(tǒng)購自日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將45只350～400 g SD大鼠(北京維通利華公司)隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和H2S組，每組15只。模型組、H2S組大鼠采用自體血腦內(nèi)注入法建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，?duì)照組不行任何手術(shù)操作；H2S組于手術(shù)當(dāng)日開始每日腹腔注射硫氫化鈉10 mg/kg，連續(xù)28 d，其余兩組僅腹腔注射等體積生理鹽水。所有大鼠均于同一SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，溫度(22±20)℃、濕度(50±10)%。

1.3 腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?4%水合氯醛腹腔麻醉后，俯臥位將大鼠固定于腦立體定位儀上，消毒頭皮后取正中切口，依次經(jīng)骨膜剝離、暴露前囟及右側(cè)尾狀核定位后，采用牙科鉆穿透顱骨備用；距尾端3 cm處剪斷鼠尾后采用微量注射器抽取未抗凝血50 μl，借助立體定位儀進(jìn)針，于尾狀核內(nèi)緩慢注射，停針5 min后緩慢退出針頭，封閉顱骨創(chuàng)口后縫合頭皮。

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià) 分別于術(shù)后4、7、14、28 d對(duì)各組進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，主要包括Longa 5 分評(píng)分法及Tarlov評(píng)分。Longa神經(jīng)學(xué)檢查評(píng)分：0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)，大鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失；5分：死亡。改良Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：完全性癱瘓，0分；有肌肉自發(fā)性收縮，1分；關(guān)節(jié)活動(dòng)好、但不能站立，2分；能站立、無法行走，3分；可行走，但晃擺，4分；正常，5分。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取8只。

1.5 腦血腫周圍血管新生情況評(píng)價(jià) 于術(shù)后14、28 d收集腦血腫周圍組織進(jìn)行CD34免疫組化染色以計(jì)算微血管密度及血管場(chǎng)面積。經(jīng)左心室4%多聚甲醛灌注后取出腦組織，依次經(jīng)固定、脫水及石蠟包埋后，留取血腫周圍切片6張，采用免疫組化SP法在鏡下檢測(cè)CD34的陽性表達(dá)情況，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞膜棕黃色顆粒者為陽性，選取5個(gè)高倍視野(400倍)進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，取平均值為微血管密度，同時(shí)采用Image Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定血管場(chǎng)面積，最終結(jié)果表示為所測(cè)有效血管截面面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的比值。

1.6 血腫周圍組織的VEGF水平檢測(cè) 分別于術(shù)后4、7、14、28 d收集各組大鼠腦組織，分離腦血腫周圍組織，于冰上加入裂解液，研磨充分后以3 000 r/min離心10 min后收集上清液，采用BCA法測(cè)定上清液的蛋白含量后，采用試劑盒檢測(cè)組織中VEGF水平，操作過程嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.7 血腫周圍組織的GAP-43水平檢測(cè) 將1.6中收集的腦血腫周圍組織依次經(jīng)固定、脫水及石蠟包埋后，留取血腫周圍切片6張，采用免疫組化SP法在鏡下檢測(cè)GAP-43陽性細(xì)胞，選取5個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)數(shù)，取平均值作為GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件。計(jì)量資料組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分情況 對(duì)照組術(shù)后各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分均為0分，提示神經(jīng)功能正常。與對(duì)照組相比，模型組的神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分均升高，且隨觀察時(shí)間延長而呈增長趨勢(shì)(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分均改善，均低于模型組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)后肢運(yùn)動(dòng)功能Tarlov評(píng)分情況 對(duì)照組術(shù)后4、7、14、28 d的Tarlov評(píng)分均為5分，提示后肢運(yùn)動(dòng)功能正常。與對(duì)照組相比，模型組的Tarlov評(píng)分均降低，且隨觀察時(shí)間延長而呈下降趨勢(shì)(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后的后肢Tarlov評(píng)分均獲改善，均高于模型組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

組別4d7d14d28d模型組1 74±0 352 11±0 272 64±0 293 21±0 39H2S組1 16±0 241)1 09±0 311)0 73±0 221)0 89±0 171)

與模型組比較：1)P<0.05

2.3 各組大鼠血腫周圍的血管新生情況 與對(duì)照組相比，模型組術(shù)后14、28 d的微血管密度和血管場(chǎng)面積均降低(P<0.05)；腦血腫大鼠經(jīng)H2S治療后的微血管密度和血管場(chǎng)面積均高于模型組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血腫周圍組織VEGF水平比較 與對(duì)照組相比，模型組術(shù)后4、7、14、28 d的VEGF水平均降低，且隨觀察時(shí)間延長而呈下降趨勢(shì)(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后VEGF水平均高于模型組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

組別4d7d14d28d對(duì)照組5555模型組3 25±0 411)2 74±0 341)1 65±0 221)0 54±0 091)H2S組3 76±0 291)2)4 37±0 411)2)4 42±0 341)2)4 63±0 281)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

組別微血管密度(個(gè))14d28d血管場(chǎng)面積(%)14d28d對(duì)照組42 17±3 5539 72±4 316 84±0 927 26±0 75模型組27 06±2 911)16 38±2 201)4 15±0 611)2 05±0 821)H2S組32 64±3 621)2)22 91±2 741)2)4 73±0 541)2)4 45±0 561)2)

組別4d7d14d28d對(duì)照組27 91±3 4525 41±2 8729 62±2 7026 18±3 07模型組22 76±2 631)17 53±1 921)14 47±1 361)12 99±2 121)H2S組25 33±2 911)2)21 70±2 351)2)19 38±2 281)2)20 73±2 461)2)

2.5 各組大鼠血腫周圍組織GAP-43水平比較 與對(duì)照組相比，模型組術(shù)后4、7、14、28 d血腫周圍組織GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)均降低，且隨觀察時(shí)間延長而呈下降趨勢(shì)(P<0.05)；腦血腫大鼠H2S治療后血腫周圍組織GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)高于模型組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

組別4d7d14d28d對(duì)照組27 91±3 4525 41±2 8729 62±2 7026 18±3 07模型組22 76±2 631)17 53±1 921)14 47±1 361)12 99±2 121)H2S組25 33±2 911)2)21 70±2 351)2)19 38±2 281)2)20 73±2 461)2)

3 討 論

H2S是一種新型的氣體信號(hào)分子，具有較廣的心血管調(diào)節(jié)活性，如舒張血管、減輕心肌缺血再灌注損傷及調(diào)節(jié)心肌收縮能力等〔7〕。近年來發(fā)現(xiàn)，其在改善神經(jīng)損傷上有一定效果，如傅智軼等〔4〕發(fā)現(xiàn)H2S對(duì)急性馬尾神經(jīng)損傷模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，劉蓓蓓等〔5〕指出外源性H2S可減輕海馬神經(jīng)元的氧糖缺失/恢復(fù)損傷，達(dá)到減輕細(xì)胞凋亡的效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)外源性H2S可能通過上調(diào)HIF-1α發(fā)揮保護(hù)作用。蔣莉等〔8〕亦發(fā)現(xiàn)外源性H2S對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的海馬神經(jīng)損傷有較好的保護(hù)效果。此外，外源性H2S對(duì)缺氧誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用〔9〕。以上結(jié)果提示外源性H2S具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，推測(cè)對(duì)腦出血血腫周圍的神經(jīng)損傷可能有保護(hù)作用。

本研究采用自體血腦內(nèi)注入法建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ停瑖?yán)格篩選成模大鼠。行為學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性H2S可改善腦出血大鼠的神經(jīng)損傷，但術(shù)后28 d仍未達(dá)到正常水平，可能原因?yàn)樗幬飫┝坎粔蚧蛘哂^察時(shí)間較短，下一步將進(jìn)行重點(diǎn)研究。血腫壓迫及血腫血液分解形成的有毒物質(zhì)可損傷神經(jīng)元，繼而引起神經(jīng)功能學(xué)行為評(píng)價(jià)異?！?0〕，本研究推測(cè)外源性H2S可能對(duì)神經(jīng)元損傷后再生有一定作用。GAP-43是新生神經(jīng)元的標(biāo)志物，其數(shù)量變化可反映神經(jīng)修復(fù)情況〔11〕。免疫組化發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)目低于正常水平，而外源性H2S處理后的GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)升高，表明外源性H2S可促進(jìn)血腫周圍神經(jīng)修復(fù)，與之前的推測(cè)一致。

微血管系統(tǒng)重建為血腫后神經(jīng)損傷修復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，故研究血腫周圍血管新生情況對(duì)于評(píng)價(jià)外源性H2S的效果有重要意義。由于CD34可用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞〔12〕，故本研究首選采用免疫組化法直接觀察血管新生情況，結(jié)果表明模型組大鼠經(jīng)外源性H2S處理后的微血管密度和血管場(chǎng)面積均升高，表明外源性H2S可促進(jìn)血腫周圍血管再生。VEGF是促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵因子〔13〕，與免疫組化的結(jié)果一致，外源性H2S可升高血腫周圍組織的VEGF水平，為證實(shí)外源性H2S可促進(jìn)血腫周圍血管再生提供了分子學(xué)證據(jù)。外源性H2S可通過KDR/mTOR/miR-640/HIF1α途徑促進(jìn)血管新生〔6〕，推測(cè)此通路可能參與了H2S對(duì)腦出血血腫周圍血管再生的促進(jìn)作用。

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〔2016-03-19修回〕

(編輯 徐 杰)

石 磊(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科疾病研究。

R651

A

1005-9202(2016)24-6058-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.005