陳 鑫

(沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院(沈陽(yáng)市腦科醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)六科，遼寧 沈陽(yáng) 110041)

姜黃素對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬細(xì)胞的影響

陳 鑫

(沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院(沈陽(yáng)市腦科醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)六科，遼寧 沈陽(yáng) 110041)

目的 探討姜黃素對(duì)阿爾茨海默病(AD)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及作用機(jī)制。方法 將48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組，每組12只。脂多糖誘導(dǎo)建立AD炎癥模型，利用八臂迷宮刺激器進(jìn)行被動(dòng)回避反應(yīng)和信號(hào)方位辨別反應(yīng)測(cè)試，觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及信號(hào)方位辨別能力的改變；觀察腦內(nèi)海馬組織切片神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)改變。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶保持率均顯著優(yōu)于模型組(P<0.01)；海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量也顯著增多，形態(tài)明顯改善，接近正常對(duì)照組和假手術(shù)組。結(jié)論 姜黃素可改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與姜黃素抗炎癥、抗氧化、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

阿爾茨海默??；姜黃素；衰老；學(xué)習(xí)；記憶

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素，現(xiàn)有的單靶點(diǎn)藥物僅能改善AD癥狀，而不能真正地起到延緩疾病的作用〔1〕。姜黃素可以抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗類風(fēng)濕〔2〕，改善AD病人的認(rèn)知功能，因此，近年來(lái)姜黃素及相關(guān)提取物逐漸應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療〔3〕。本文進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力及信號(hào)辨別學(xué)習(xí)能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 脂多糖(LPS)、姜黃素均為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品。ZH-3000型八臂迷宮刺激器、ZH-藍(lán)星B型腦立體定位儀、ZH-RXZ型柔性露骨鉆均為淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。60只SPF級(jí)C57BL/6小鼠，2～3月齡，體質(zhì)量20～25 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 AD動(dòng)物模型的建立及分組 48只C57BL/6小鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(20～30 mg/kg)。根據(jù)腦立體定位儀，選定小鼠黑質(zhì)致密部注射LPS 5 μg，1 μg/min建立AD模型〔4〕；利用八臂迷宮刺激器對(duì)小鼠進(jìn)行被動(dòng)回避反應(yīng)能力和辨別學(xué)習(xí)能力的測(cè)試，篩選出AD模型小鼠。12只小鼠定位后在黑質(zhì)致密部注射相同劑量生理鹽水設(shè)為假手術(shù)組；12只造模成功的小鼠腹腔注射姜黃素50 mg/kg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，連續(xù)7 d，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；模型組不再進(jìn)行任何干預(yù)。另取12只未進(jìn)行造模的小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.3 學(xué)習(xí)和記憶能力的測(cè)試 采用八臂迷宮刺激器進(jìn)行暗環(huán)境被動(dòng)回避反應(yīng)測(cè)試，八臂迷宮刺激器的八臂等長(zhǎng)，均為47.5 cm，隔離區(qū)的直徑為46.5 cm，底面均布有直徑0.3 cm、間距1.2 cm的鋁柵；在每臂頂端裝一個(gè)15 w燈。將小鼠放入用黑布遮蓋做的1～8臂區(qū)，適應(yīng)后1臂放置燈光(安全區(qū))，由于小鼠已習(xí)慣暗適應(yīng)，會(huì)自動(dòng)進(jìn)入2～8臂區(qū)；此時(shí)打開(kāi)2～8臂區(qū)和的電源鍵通以交流電(0.3 mA，50 Hz)〔5〕，小鼠受電擊會(huì)自動(dòng)逃回1臂。根據(jù)分析小鼠躲避策略即進(jìn)入安全區(qū)的次數(shù)、時(shí)間、正確次數(shù)、錯(cuò)誤次數(shù)、路線等參數(shù)可以反映出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶能力。每天訓(xùn)練20次，每次間隔20 s，觀察各組小鼠停止訓(xùn)練后1 w的記憶保持力。然后停止訓(xùn)練，1 w后再繼續(xù)。

1.4 方位辨別能力的測(cè)試 隨機(jī)選取八臂迷宮刺激器某一臂為安全區(qū)，無(wú)電通光，其余2～8臂區(qū)通以交流電(0.3 mA,50 Hz)，但不通光。將小鼠放入安全區(qū)開(kāi)始測(cè)試，10 s后無(wú)規(guī)則隨機(jī)變換安全區(qū)，小鼠受電擊后會(huì)尋找無(wú)電但通光的安全區(qū)，根據(jù)分析小鼠躲避策略測(cè)試小鼠辨燈及安全方位能力。每天訓(xùn)練20次，每次間隔30 s，觀察各組小鼠訓(xùn)練1 w后正確反映能力，然后停止訓(xùn)練，1 w后再繼續(xù)。正確反應(yīng)率(正確率=正確反應(yīng)次數(shù)/20×100%)。

1.5 腦內(nèi)海馬組織切片神經(jīng)元細(xì)胞觀察 行為學(xué)觀察后，各組小鼠脫頸處死，10%的甲醛溶液心臟滴注固定，取腦組織并分離海馬，將海馬用沙布包好置于10%的甲醛溶液固定24 h后，脫水固定包埋制成石蠟塊，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察并照相。

1.6 海馬細(xì)胞存活率和凋亡率檢測(cè) MTT法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，在490 mm波長(zhǎng)下測(cè)各孔的吸光度值(OD)；海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說(shuō)明書操作，6 h以內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件行方差分析(F檢驗(yàn))。

2 結(jié) 果

2.1 AD模型的篩選 48只AD模型小鼠根據(jù)八臂迷宮刺激器進(jìn)行被動(dòng)回避反應(yīng)能力和辨別學(xué)習(xí)能力的測(cè)試，低于正常小鼠，且出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、少動(dòng)、豎毛、尾部強(qiáng)直等異常行為，判定造模成功。各組小鼠均未發(fā)生脫失。

2.2 AD小鼠學(xué)習(xí)和記憶力的改變 實(shí)驗(yàn)組學(xué)習(xí)完成所需訓(xùn)練次數(shù)和停止訓(xùn)練后進(jìn)洞潛伏期均有顯著改善(P<0.01)，但與正常對(duì)照組比較仍有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 AD小鼠方位辨別學(xué)習(xí)能力的改變 隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組小鼠正確反應(yīng)率均緩慢上升，其中實(shí)驗(yàn)組顯著好于模型組，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相近，1 w左右達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降，模型組下降最為顯著。見(jiàn)圖1。

2.4 小鼠腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 正常對(duì)照組顯微鏡下可見(jiàn)胞體輪廓清晰，海馬神經(jīng)元突起較大，而模型組海馬元細(xì)胞的突起變小，細(xì)胞有不同程度的損傷，胞質(zhì)減少，核仁不清晰。實(shí)驗(yàn)組鏡下細(xì)胞突觸雖然略小于正常對(duì)照組作文手術(shù)組，但基本接近正常形態(tài)，神經(jīng)元數(shù)量顯著多于模型組。見(jiàn)圖2。

組別學(xué)習(xí)完成所需訓(xùn)練次數(shù)(次)停止訓(xùn)練后進(jìn)洞潛伏期(min)正常對(duì)照組6 25±1 331)10 82±2 621)模型組11 53±2 716 25±1 321)假手術(shù)組6 57±1 141)9 86±1 831)實(shí)驗(yàn)組7 81±2 981)2)8 78±92 541)2)F值18 63216 507

與模型組比較:1)P<0.01；與正常對(duì)照組比較:2)P<0.01；下表同

圖1 各組小鼠信號(hào)方位辨別能力的測(cè)試

圖2 各組小鼠腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，×100)

2.5 各組小鼠腦海神經(jīng)細(xì)胞存活和凋亡的比較 與其他三組比較，模型組小鼠海馬細(xì)胞存活率顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)；而實(shí)驗(yàn)組兩項(xiàng)指標(biāo)顯著好于模型組，與假手術(shù)組接近，但與正常對(duì)照組還存在一定差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別細(xì)胞存活率細(xì)胞凋亡率正常對(duì)照組90 25±1 371)10 05±0 221)模型組61 34±1 3319 57±1 02假手術(shù)組87 01±1 251)12 12±0 341)實(shí)驗(yàn)組83 13±1 291)2)15 50±0 571)2)F值21 78419 415

3 討 論

過(guò)量β淀粉樣蛋白(Aβ)(又稱老年斑)的生成、聚集和沉積能引起一系列的神經(jīng)毒性。Aβ被看成是AD三大病因之一和主要作用機(jī)制；另外，還有神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)、神經(jīng)元丟失，累及的皮層動(dòng)脈和小動(dòng)脈出現(xiàn)血管淀粉樣變性。該病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚無(wú)有效治療措施。有研究認(rèn)為免疫炎癥機(jī)制參與了AD病理的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。臨床很多證據(jù)也表明神經(jīng)炎癥對(duì)神經(jīng)退行性疾病病理機(jī)制具有刺激作用。因此，抗炎治療策略以及抗炎癥藥物對(duì)癥治療可能是將來(lái)AD的一種治療方法〔6〕。

近年來(lái)，姜黃素的抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、促凋亡等藥理作用已在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中得到證實(shí),姜黃素可抗AD的形成、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制，可以在多個(gè)環(huán)節(jié)起調(diào)節(jié)作用，特別是在基因及信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)多重水平中的作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)〔7〕。臨床研究顯示姜黃素具有活性高、毒副作用小的特點(diǎn)，是防治老年癡呆的理想藥物。楊宇等〔8〕觀察姜黃素治療后AD炎癥及神經(jīng)元的變化，轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)較多凋亡的神經(jīng)元，而在野生型小鼠中幾乎未見(jiàn)凋亡神經(jīng)元；姜黃素治療組小鼠中見(jiàn)到少量散在的凋亡神經(jīng)元，轉(zhuǎn)基因小鼠中Bax的表達(dá)明顯高于野生型小鼠和姜黃素治療組小鼠,而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量顯著低于其余兩組(P<0.05)，說(shuō)明姜黃素治療AD小鼠可以改善小鼠的認(rèn)知功能，并且有效地減少炎癥因子的產(chǎn)生、減少神經(jīng)元的凋亡。李厚忠等〔9〕觀察姜黃素對(duì)AD模型小鼠海馬組織中丙二醛(MDA)濃度、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GSH-Px)活性的影響，以及觀察海馬區(qū)病理組織，結(jié)果顯示姜黃素可抑制自由基生成并加強(qiáng)其清除而發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化保護(hù)作用，保護(hù)生物大分子免遭自由基的毒性作用，從而保護(hù)機(jī)體組織器官。同時(shí)，姜黃素可以改善AD模型小鼠海馬功能異常和病理組織學(xué)改變。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)和信號(hào)方位辨別試驗(yàn)，證明姜黃素改善了小鼠AD的炎癥狀態(tài)，并進(jìn)一步顯示對(duì)AD海馬細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用。

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〔2016-08-31修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 鑫(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科相關(guān)疾病的診斷與治療研究。

R749

A

1005-9202(2016)24-6056-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.004