李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，王 妍，高金偉，王曉梅,通信作者，陳成勛，李 濤，莫寶霖

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350；3. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

革胡子鯰MHC基因表達(dá)qPCR分析的引物設(shè)計(jì)與評(píng)估

李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1，王 妍2，高金偉1，王曉梅1,通信作者，陳成勛1，李 濤3，莫寶霖1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350；3. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析革胡子鯰主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）基因的表達(dá)譜，本研究利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增革胡子鯰MHC基因片段的引物并進(jìn)行qPCR評(píng)估。結(jié)果顯示：引物MHCF1-MHCR3在qPCR擴(kuò)增時(shí)，融解曲線為單一尖銳峰；標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示：引物的擴(kuò)增效率為99.3％，R2值為0.998。上述結(jié)果說明該對(duì)引物具有良好的擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率，滿足了qPCR擴(kuò)增的要求。本研究為革胡子鯰MHCⅠ基因表達(dá)的qPCR分析奠定了基礎(chǔ)。

革胡子鯰；主要組織相容性復(fù)合體；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；融解曲線；擴(kuò)增效率

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是由位于染色體上高度多態(tài)、緊密連鎖的基因位點(diǎn)組成；在機(jī)體的特異性免疫中發(fā)揮重要作用的基因家族[1-2]。魚類的MHC主要包括MHCⅠ和MHCⅡ兩類分子，分別負(fù)責(zé)內(nèi)源性和外源性抗原的加工和呈遞，與疾病的抗性和易感性密切相關(guān)[3-4]。自從1990年Hashimoto等[5]報(bào)道鯉魚MHCⅠ類和MHCⅡ的部分基因序列以來，數(shù)十種魚類的MHC的基因序列、基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)譜得到了廣泛研究[1-2,6-10]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qPCR）是指在反應(yīng)體系中加入熒光分子，分析和檢測(cè)反應(yīng)過程中的累積擴(kuò)增產(chǎn)物，其結(jié)果可以用于定性和定量分析[11]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的檢測(cè)模式有探針類和染料類兩種；探針類是指利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增子的拷貝數(shù)的變化，而染料類則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征來檢測(cè)擴(kuò)增子拷貝數(shù)的變化；前者的的特異性強(qiáng)，而后者操作簡(jiǎn)便易行、成本較低[12]。因此，在基因表達(dá)的qPCR分析中染料法使用居多。

革胡子鯰（Clarias gariepinus）屬鯰形目（Siluriformes）、胡鯰科（Clariidae）、胡鯰屬（Clarias）的魚類。由于該魚可高密度養(yǎng)殖、生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、耐低氧、適應(yīng)性強(qiáng)，自1981年從埃及引入我國(guó)后，已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。然而，目前有關(guān)革胡子鯰的研究主要集中于人工養(yǎng)殖[13-14]、養(yǎng)殖條件對(duì)生長(zhǎng)性能和生理生化指標(biāo)[15-18]和對(duì)器官組織學(xué)的影響[19]以及雜交育種[20-21]等方面，卻鮮見有關(guān)革胡子鯰高抗病力方面的基礎(chǔ)性研究。因此，本文應(yīng)用適宜的分子生物學(xué)軟件和方法，擬獲得革胡子鯰MHC基因表達(dá)qPCR分析的相關(guān)引物，旨在為今后分析革胡子鯰MHC基因的表達(dá)譜、深入探討高密度養(yǎng)殖條件下革胡子鯰高抗病的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用魚10尾取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司水泥養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖密度約為180 kg/m3，體長(zhǎng)（34.80±3.00）cm，體重（395.99±71.59）g。經(jīng)200 mg/L MS-222 麻醉后，解剖取出其鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟，液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

應(yīng)用Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）提取革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟4種組織的總RNA?？俁NA經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，超微量分光光度計(jì)（德國(guó)IMPLEN公司）分析其純度。應(yīng)用RevertAidTMcDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA第一條鏈?？俁NA的提取和cDNA第一條鏈的合成依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3 引物的設(shè)計(jì)、常規(guī)PCR篩選及擴(kuò)增子驗(yàn)證

依據(jù)GenBank公布的革胡子鯰MHCⅠ的基因序列信息（GenBank檢索號(hào)：EU714321），應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

選取任意個(gè)體的鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的cDNA進(jìn)行MHC基因片段的常規(guī)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，包括1×PCR Buffer，2 mmol/L Mg2＋，0.2 mmol/L dNTP，0.4 μmol/L 引物，1.5 UTaq酶，cDNA 1 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min的預(yù)變性后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共33個(gè)循環(huán)，之后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠、5 V/cm的恒壓電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)SYNGENE公司）觀察與拍照。

對(duì)得到的MHCⅠ基因的單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序（測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成），測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序在線對(duì)比驗(yàn)證。

1.4 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估

依據(jù)本試驗(yàn)獲得的MHC基因序列以及qPCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于基因qPCR分析的引物，經(jīng)過常規(guī)PCR檢測(cè)后，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

qPCR擴(kuò)增應(yīng)用Iq SYBR Green Supermix試劑盒進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增體系如下：10 μL iQ SYBR Green Supermix預(yù)混液，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，1 μL cDNA，7 μL PCR水；擴(kuò)增循環(huán)采用兩步法，即95 ℃預(yù)變性3 min后，95 ℃ 5 s、一定溫度的退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

退火溫度的優(yōu)化：根據(jù)引物的Tm值，設(shè)置3個(gè)退火溫度，對(duì)MHC的基因片段進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)為2個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)進(jìn)行融解分析，并設(shè)置陰性對(duì)照（用PCR水替代cDNA）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以cDNA原液為最高濃度，采用10倍稀釋法獲得5個(gè)不同濃度的cDNA模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)為3個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)分析其融解，并設(shè)置陰性對(duì)照（用PCR水替代cDNA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)結(jié)果

革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟4種組織的總RNA經(jīng)檢測(cè)顯示28S rRNA、18S rRNA條帶亮度比值在1～2之間（圖1），OD260/OD280均在1.8～2.0之間（結(jié)果未列出）。

圖1 革胡子鯰4種組織總RNA電泳分離結(jié)果（泳道1～4分別為鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的總RNA電泳圖譜）

2.2 引物的設(shè)計(jì)、常規(guī)PCR篩選及擴(kuò)增子的驗(yàn)證結(jié)果

依據(jù)GenBank檢索的革胡子鯰MHCⅠ的基因序列（EU714321），應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物得出的引物中，只有2對(duì)引物（表1）適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 引物序列信息

以革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的cDNA為模板，對(duì)表1顯示的2對(duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增篩選。圖2顯示：引物MHCF1-MHCR1的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一個(gè)約為260 bp的擴(kuò)增條帶（泳道1～4）；而引物MHCF2-MHCR2的擴(kuò)增產(chǎn)物包含約為200 bp和450 bp的兩條擴(kuò)增帶，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的結(jié)果，450 bp左右的帶紋應(yīng)為非特異性擴(kuò)增條帶（泳道5～7）。

圖2 常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物MHCⅠ1和MHCⅠ2的電泳結(jié)果（泳道M：DNA分子標(biāo)量；1～4：鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的擴(kuò)增產(chǎn)物MHCⅠ1；5～8：鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的擴(kuò)增產(chǎn)物MHCⅠ2）

對(duì)擴(kuò)增后獲得的單一產(chǎn)物MHCⅠ1進(jìn)行測(cè)序，其序列包含引物為254 bp。該序列進(jìn)行GenBank BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示：MHCⅠ1與已報(bào)道革胡子鯰MHCⅠ的cDNA序列（序列號(hào)：EU714321.1）一致性為99％（圖3）。

圖3 MHCⅠ1基因片段序列GenBank BLAST對(duì)比結(jié)果（BLAST比對(duì)網(wǎng)頁截圖）

2.3 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估結(jié)果

2.3.1 qPCR引物的設(shè)計(jì)

盡管引物MHCF1-MHCR1的常規(guī)PCR具有擴(kuò)增特異性，且擴(kuò)增子的序列經(jīng)GenBank在線比對(duì)為革胡子鯰MHCⅠ基因片段序列，但擴(kuò)增子大小為254 bp，所以該對(duì)引物并非qPCR擴(kuò)增的優(yōu)良引物。因此，根據(jù)本試驗(yàn)得到的254 bp的MHCⅠ基因序列，設(shè)計(jì)并得到1對(duì)擬用于qPCR擴(kuò)增的引物：MHCF1-MHCR3（表2）。通過對(duì)該對(duì)引物的常規(guī)PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物（MHCⅠ3）為單一條帶（圖4），大小與理論值相符，測(cè)序?yàn)?37 bp。

表2 擬用于qPCR擴(kuò)增的引物序列信息

圖4 擴(kuò)增產(chǎn)物MHCⅠ3的電泳結(jié)果（泳道M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的擴(kuò)增產(chǎn)物MHCⅠ3）

2.3.2 引物的qPCR評(píng)估

根據(jù)引物MHCF1-MHCR3的Tm值，設(shè)置57、60和63 ℃ 3個(gè)退火溫度進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。3個(gè)退火溫度下每個(gè)qPCR反應(yīng)的融解均為一個(gè)尖銳峰（結(jié)果未顯示）。表3中的數(shù)據(jù)顯示了該對(duì)引物在3個(gè)退火溫度下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增的Ct值，其中以退火溫度為60 ℃時(shí)的Ct值最小。

表3 引物MHCF1-MHCR3在不同退火溫度下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)得到的Ct值

采用60 ℃為退火溫度，應(yīng)用引物MHCF1-MHCR3對(duì)系列稀釋cDNA樣本進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：在指數(shù)擴(kuò)增區(qū)相鄰的擴(kuò)增曲線間隔相似（圖5A）、每個(gè)反應(yīng)的融解曲線為單一尖銳峰（圖5B）、從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出引物的擴(kuò)增效率為99.3％，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值為0.998（圖5C）。

圖5 引物MHCF1-MHCR3 qPCR的擴(kuò)增曲線（A）、融解曲線（B）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（C）

3 討論

RNA完整性和純度是影響qPCR擴(kuò)增最基本的因素。若使用有其他物質(zhì)污染或降解的RNA樣本進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，會(huì)產(chǎn)生數(shù)據(jù)的偏離或不穩(wěn)定的數(shù)據(jù)[22]。總RNA樣本的28S/18S rRNA的條帶亮度比值在1～2之間表示完整性好，而OD260/OD280在1.8～2.0之間表示RNA樣本純度高，沒有蛋白和酚的污染。本試驗(yàn)提取的革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟4種組織的總RNA樣本經(jīng)檢測(cè)滿足上述條件，因此保證了本試驗(yàn)中qPCR結(jié)果的可靠性。

引物序列對(duì)qPCR擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增效率至關(guān)重要。PCR擴(kuò)增的引物一般應(yīng)遵循以下原則：GC含量為50％～60％，Tm值為50～65 ℃，引物自身和引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，從而避免產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體；而對(duì)于qPCR擴(kuò)增還要求擴(kuò)增子的長(zhǎng)度最好在75～200 bp之間，片段越長(zhǎng)擴(kuò)增效率越低[11]。本研究基于GenBank公布的革胡子鯰MHCⅠ基因546 bp的序列（EU714321），僅得到2對(duì)分值高的引物，即：MHCF1-MHCR1和MHCF2-MHCR2，擴(kuò)增子大小的理論值分別為255 bp和189 bp。在常規(guī)PCR中，引物MHCF1-MHCR1的擴(kuò)增子大小為260 bp左右，與理論值相符且擴(kuò)增產(chǎn)物無雜帶；而引物MHCF2-MHCR2的擴(kuò)增產(chǎn)物除了包含有目的條帶外，還有一條約450 bp的非特異條帶，表明其擴(kuò)增的特異性差，應(yīng)將其舍棄。前者擴(kuò)增的特異性雖強(qiáng)，但其擴(kuò)增子的大小不符合qPCR擴(kuò)增的最佳要求。因此，本研究對(duì)引物MHCF1-MHCR1擴(kuò)增的260 bp產(chǎn)物測(cè)序，基于該測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步設(shè)計(jì)出擬用于qPCR試驗(yàn)的引物：MHCF1-MHCR3，擴(kuò)增子大小的理論值為137 bp。該對(duì)引物常規(guī)PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶單一，且擴(kuò)增子大小與理論值一致。因此對(duì)引物MHCF1-MHCR3進(jìn)行了qPCR的進(jìn)一步評(píng)估。

在qPCR擴(kuò)增時(shí)，每次均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照且無擴(kuò)增信號(hào)；所有的擴(kuò)增樣本都應(yīng)有2～3個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)技術(shù)重復(fù)樣本的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)＜0.5，否則應(yīng)對(duì)樣本重新進(jìn)行qPCR擴(kuò)增[11]。本試驗(yàn)中的陰性對(duì)照均無擴(kuò)增信號(hào)，qPCR擴(kuò)增樣本的2個(gè)重復(fù)（退火溫度優(yōu)化）或3個(gè)重復(fù)（標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立）中，重復(fù)樣本的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差在0.056～0.397之間（本文僅顯示了退火溫度優(yōu)化的重復(fù)樣本的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差），說明本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

退火溫度的高低影響引物與目標(biāo)序列的退火，不適宜的退火溫度可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成，因此在qPCR試驗(yàn)中要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。引物擴(kuò)增的特異性是qPCR分析成敗的關(guān)鍵，因此在進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的同時(shí)要進(jìn)行融解分析，判斷引物擴(kuò)增的特異性。融解曲線若為單一尖銳峰則表明引物的qPCR擴(kuò)增為特異性反應(yīng)；相反，如果在融解曲線上不只有一個(gè)波峰則表明有非特異性的反應(yīng)，應(yīng)淘汰該引物[11,22-23]。本試驗(yàn)根據(jù)引物的Tm值，設(shè)定3個(gè)溫度進(jìn)行qPCR退火溫度的優(yōu)化。結(jié)果顯示：在退火溫度優(yōu)化的試驗(yàn)中，每個(gè)qPCR擴(kuò)增反應(yīng)的融解曲線均為單一尖銳峰，說明引物的特異性強(qiáng)。此外，根據(jù)qPCR擴(kuò)增的原則，應(yīng)選擇Ct值最小的退火溫度進(jìn)行后續(xù)的qPCR分析。本試驗(yàn)中退火溫度為60 ℃時(shí)，qPCR擴(kuò)增的Ct值最小，故選擇60 ℃作為退火溫度對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)。

引物除了具有擴(kuò)增特異性外還應(yīng)具有良好的擴(kuò)增效率，才能最終用于試驗(yàn)樣本的qPCR分析。qPCR的擴(kuò)增效率一般通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定，而標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過對(duì)一系列倍比稀釋的cDNA模板進(jìn)行qPCR而得出。優(yōu)良的qPCR引物，對(duì)系列稀釋cDNA模板產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線應(yīng)間隔均勻、擴(kuò)增效率在90％～105％之間、標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）＞0.980[11,22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示引物MHCF1-MHCR3對(duì)系列稀釋樣本的擴(kuò)增曲線的間隔相似、擴(kuò)增效率為99.3％、標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.998；同時(shí)，所有qPCR反應(yīng)的融解曲線均為單一尖銳峰。

上述對(duì)引物MHCF1-MHCR3的退火溫度優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的試驗(yàn)結(jié)果表明該對(duì)引物可以用于樣本的qPCR分析。這一研究為今后革胡子鯰MHC基因的定量表達(dá)分析以及進(jìn)一步探討高密度養(yǎng)殖條件下革胡子鯰高抗病的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

[1] 王曉冰，劉至治，李強(qiáng)，等. 金錢魚MHC II β基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性與組織表達(dá)分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2016，23（1）：21?33.

[2] 鄭風(fēng)榮，郭湘云，劉洪展，等. 星斑川鰈MHC Ⅱ恒定鏈Ii基因的克隆和表達(dá)特性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2016，40（2）：145?155.

[3] 李春梅，張全啟，齊潔，等. 魚類MHC 基因的研究概況[J]. 海洋湖沼通報(bào)，2009（4）：39?50.

[4] 賈震虎，夏春. 硬骨魚類MHCⅠ基因結(jié)構(gòu)與抗病力關(guān)系探討[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（3）：61?62.

[5] Hashimoto K， Nakanishi T， Kurosawa Y. Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigens[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87：6863?6867.

[6] Grimholt U，Hordvik I，F(xiàn)osse V M，et al. Molecular cloning of major histocompatibility complex class I cDNAs from Atlantic salmon（Salmon salar）[J].Immunogenetics，1993，37：469?473.

[7] Maureen B Peters，Thomas F Turner. Genetic variation of the major histocompatibility complex（MHC class II b gene）in the threatened Gila trout，Oncorhynchus gilae gilae[J].Conservation Genetics，2008，9：257?270.

[8] 周芬娜，董忠典，李同明，等. 尼羅羅非魚MHCⅡA 基因的克隆、表達(dá)及多態(tài)性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（8）：1167?1178.

[9] 沈銘輝，鄭樂云，杜佳瑩，等. 赤點(diǎn)石斑魚MHCⅠA基因的克隆與表達(dá)多態(tài)性分析[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，52（1）：103?108.

[10] Pang J C，Gao F Y，Lu M X，et al. Major histocompatibility complex class IIA and IIB genes of Nile tilapiaOreochromis niloticus：Genomic structure，molecular polymorphism and expression patterns[J].Fish & Shellfish Immunology，2013，34（2）：486?496.

[11] 美國(guó)BIO-RAD科技公司. 熒光定量PCR應(yīng)用指南[M]. 2010.

[12] 趙煥英，包金風(fēng). 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16（4）：492?497.

[13] 李恒國(guó)，朱興國(guó)，閔憲偉. 高密度集約化革胡子鯰養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 漁業(yè)致富指南，2006（8）：31?32.

[14] 何順昌. 革胡子鯰池塘精養(yǎng)高產(chǎn)技術(shù)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2009（2）：34?35.

[15] Appelbaum S，Kamler E. Survival，growth，metabolism and behaviour ofClarias gariepinus（Burchell 1822）early stages under different light conditions[J].Aquacultural Engineering，2000，22：269–287.

[16] Van de Nieuwegiessen P G，Olwo J，Khong S，et al. Effects of age and stocking density on the welfare of African catfish，Clarias gariepinusBurchell[J].Aquaculture，2009，288：69–75.

[17] Bel?o T C，Leite C A C，F(xiàn)lorindo L H，et al. Cardiorespiratory responses to hypoxia in the African catfish，Clarias gariepinus（Burchell 1822），an air-breathing fish[J].Journal of Comparative Physiology B，2011，181：905–916.

[18] Dai W，Wang X M，Guo Y J，et al. Growth performance，hematological and biochemical responses of African catfish（Clarias gariepinus）reared at different stocking densities[J].African Journal of Agricultural Research，2011，6（28）：6177–6182.

[19] Olurin，K B，Olojo E A A，Mbaka G O，et al. Histopathological responses of the gill and liver tissues ofClarias gariepinusfingerlings to the herbicide，glyphosate[J].African Journal of Biotechnology，2006，5（24）：2480–2487.

[20] 張建群. 革胡子鯰與本地胡子鯰雜交試驗(yàn)[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989（3）：41?42.

[21] Wachirachaikarn A，Rungsin W，Srisapoome P，et al. Crossing of African catfish，Clarias gariepinus（Burchell，1822），strains based on strain selection using genetic diversity data[J].Aquaculture，2009，290：53–60.

[22] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)-MIQE指南[Z].美國(guó)BIO-RAD科技公司，2009.

[23] He Xiang-jun，Zhang Qi，Liu Yu-jing，et al. Increasing specificity of real time PCR to detect micro RNA through primer design and annealing temperature increase[J].Journal of Peking University（Health Sciences），2009，41（6）：691?698.

Design and Evaluation of Primers for Analysis on MHC Gene Expression Profiles ofClarias gariepinusby Using Real-Time Quantitative PCR Technique

LI Zhuan-zhuan1, WANG Yan2, GAO Jin-wei1, WANG Xiao-mei1,CorrespondingAuthor, CHEN Cheng-xun1, LI Tao3, MO Bao-lin1
（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Ocean Pal Carol Biotech CO, Ltd, Tianjin 300350, China; 3. College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to analyze the MHC gene expression profiles inClarias gariepinusby using real-time quantitative PCR（qPCR）technique, primer pairs for amplifying the MHC gene fragments ofC. gariepinuswere designed using Primer 5.0 software and then assessed by means of general PCR and qPCR amplification, respectively. The results of qPCR evaluation showed that melt curve of the primer pair named MHCF1-MHCR3presented a single sharp peak, and standard curve displayed that its amplification efficiency was 99.3％ andR2value was 0.998. The results indicated that the primer pair had good specificity and efficiency of amplification as well as met the criteria of qPCR amplification. This work laid a foundation for analyzing MHC gene expression ofC. gariepinusby using qPCR technique.

Clarias gariepinus; major histocompatibility complex; real-time fluorescence quantitative PCR; melt peak; amplification efficiency

S965.128

A

1008-5394（2016）04-0033-05

2016-03-23

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（重點(diǎn)項(xiàng)目）“革胡子鯰抗菌肽提取與鑒別及非特異免疫因子的分子解析”（15JCZDJC33500）；天津農(nóng)學(xué)院中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃“漁業(yè)資源利用與生態(tài)修復(fù)”（無編號(hào)）

李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)（1992-），女，山西呂梁人，本科在讀，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué)的研究。E-mail：1297036725@qq.com。

王曉梅（1962-），女，天津市人，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué)的研究。E-mail：xiaomeiw@tjau.edu.cn。