荊哲，劉峰舟，陳永清，劉燕，陳沖，景策

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050；2.解放軍九四一九五部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)；3.解放軍第四五一醫(yī)院門(mén)診部；4.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院內(nèi)分泌科)

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糖尿病小鼠心肌組織中動(dòng)力相關(guān)蛋白1的表達(dá)變化

荊哲1，劉峰舟2，陳永清1，劉燕1，陳沖3，景策4

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050；2.解放軍九四一九五部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)；3.解放軍第四五一醫(yī)院門(mén)診部；4.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院內(nèi)分泌科)

目的 觀察db/db糖尿病小鼠與正常小鼠心肌組織中動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Drp1)表達(dá)水平的變化。方法 9只雄性db/db糖尿病小鼠，隨機(jī)分為6周組(db/db 6week)，12周組(db/db 12week)，18周組(db/db 18week)；另設(shè)健康組雄性小鼠9只，隨機(jī)分為6周組(wt 6week)，12周組(wt 12week)，18周組(wt 18week)，每小組3只。分別利用實(shí)時(shí)定量PCR，Western Blot，免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)心肌組織中Drp1的表達(dá)和定位。結(jié)果 db/db糖尿病小鼠分組中Drp1的表達(dá)低于健康組，且隨年齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低。結(jié)論 糖尿病小鼠中Drp1表達(dá)進(jìn)行性的降低，引起線粒體分裂異常從而導(dǎo)致線粒體的生物功能障礙，可能是糖尿病心肌病發(fā)生及發(fā)展的重要機(jī)制之一。

糖尿病,2型；心??；動(dòng)力蛋白質(zhì)Ⅰ；線粒體,心臟；小鼠，近交DBA

糖尿病是一種以胰島素分泌絕對(duì)或者相對(duì)不足為主要特征，表現(xiàn)為高血糖、高血脂的代謝紊亂性疾病[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，發(fā)病率逐年增高，近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中70%以上死于心血管相關(guān)性疾病，明顯高于非糖尿病患者心血管系統(tǒng)疾病[2]。而其中糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心臟并發(fā)癥之一[3]。糖尿病心肌病是糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌多處局灶性壞死[4]。早期主要表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性下降和舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為充血性心力衰竭[5]。

線粒體在細(xì)胞的生命進(jìn)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[6]，有研究顯示，線粒體功能障礙對(duì)糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展起著直接作用[7]。其中線粒體融合與分裂這一動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定，對(duì)于維持線粒體自身生物學(xué)功能至關(guān)重要[8]。動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Drp1)是介導(dǎo)線粒體分裂的重要分子之一，又被稱(chēng)為DLP1(dynamin-like protein 1)，該分子為一個(gè)大GTP酶分子，結(jié)構(gòu)為N端具有GTP酶結(jié)構(gòu)域，C端為GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，中間為Dynamin同源結(jié)構(gòu)域[9-10]。Drp1主要分布于細(xì)胞漿中，但其結(jié)構(gòu)中的一部分在線粒體管狀結(jié)構(gòu)上呈點(diǎn)狀分布，為線粒體的分裂位點(diǎn)[11]。雖然目前已有研究證實(shí)在心血管病相關(guān)事件中存在著線粒體分裂與融合的動(dòng)力學(xué)改變[12-13]，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究在糖尿病心肌病中的報(bào)道。

本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠糖尿病心肌病模型，探討不同周齡糖尿病心肌組織中Drp1的表達(dá)變化，期望進(jìn)一步闡述糖尿病心肌病中心肌線粒體分裂與融合這一動(dòng)力學(xué)變化在糖尿病心肌病發(fā)生及發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將9只雄性db/db糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組，每組3只，分別飼養(yǎng)至6周(db-6W)，12周(db-12W)，18周(db-18W)；另將9只健康雄性小鼠分為三組，每組三只，分別飼養(yǎng)至6周(wt-6W)，12周(wt-12W)，18周(wt-18W)。動(dòng)物購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK蘇2011-0003)。飼養(yǎng)到對(duì)應(yīng)周齡后處死，取心臟左心室組織供實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 Western Blot檢測(cè)Drp1蛋白表達(dá)水平 采用聚丙烯凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)，80 V進(jìn)行上層膠電泳，120 V進(jìn)行下層膠電泳2 h后，采用濕轉(zhuǎn)的法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V恒壓，1 h)。5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，Drp1抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司)稀釋比例為1∶500，β-actin抗體(購(gòu)自武漢三贏公司)稀釋比例為1∶3000,4 ℃封閉過(guò)夜，兔二抗IgG抗體室溫孵育2 h后，化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Drp1 mRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)不同處理組中心肌組織Drp1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。Trizol(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)法提取心肌組織的總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，嚴(yán)格按照PCR檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作(購(gòu)自TaKaRa公司)。擴(kuò)增Drp1基因的引物序列上游為：5'-CGTAGTGGGAACGCAGAG-3'，下游為5'- ACAGGCACCTTGGTCATT-3';擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH基因的引物序列上游為：5'- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游為5'- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Drp1的表達(dá)及定位 采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)Drp1的表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證并觀察其表達(dá)定位。Drp1稀釋比例1∶100。3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸鈉高壓煮沸3 min抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育，加一抗后4 ℃過(guò)夜，PBS緩沖液震蕩清洗后分別滴加二抗及三抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，常規(guī)封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織Drp1 mRNA表達(dá) 分別飼養(yǎng)db/db及健康組小鼠6周，12周，18周后，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Drp1 mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中Drp1的mRNA水平明顯低于健康組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低，見(jiàn)圖1。

2.2 心肌組織 Drp1蛋白表達(dá) 為了進(jìn)一步明確Drp1在糖尿病心肌組織中的表達(dá)情況，采用Western Blot檢測(cè)Drp1在心肌組織中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中Drp1的蛋白表達(dá)明顯低于健康組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低，這與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果相一致(圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué) 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)明確了在db/db糖尿病小鼠中Drp1的mRNA及蛋白表達(dá)水平較健康組明顯降低，為了進(jìn)一步探究Drp1在心肌組織中的定位情況，采用免疫組織化學(xué)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性信號(hào)呈棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞包漿中，部分定位于線粒體，與線粒體的排列位置相一致，呈珠串狀，且在db/db糖尿病心肌組織中表達(dá)明顯低于健康組(圖3)。

3 討論

糖尿病心肌病已日益成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，它的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，近年來(lái)已逐漸成為人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。最近有研究認(rèn)為，糖尿病心肌病的發(fā)生與線粒體功能的紊亂直接相關(guān)[4]。Drp1通過(guò)對(duì)線粒體分裂與融合的調(diào)控，影響線粒體的生物學(xué)功能。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞中，Drp1在氧化應(yīng)激過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控線粒體的分裂融合。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，Drp1與心肌細(xì)胞的衰老具有明顯的相關(guān)性。但Drp1在糖尿病心肌病中的作用及其機(jī)制尚不十分清楚。

本研究以db/db糖尿病小鼠為糖尿病心肌病疾病模型，首先檢測(cè)了Drp1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)db/db糖尿病小鼠心肌組織中Drp1 mRNA水平明顯低于健康組，且與小鼠的周齡呈明顯的負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，采用Western Blot對(duì)Drp1的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果提示與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果相一致。免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Drp1主要表達(dá)于胞漿，少數(shù)表達(dá)于線粒體，其排列方式與線粒體在細(xì)胞中的分布相一致。

綜上認(rèn)為，在糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，Drp1的表達(dá)呈明顯的進(jìn)行性降低，這種改變可能導(dǎo)致線粒體的分裂與融合的平衡被打破，使線粒體的生物學(xué)功能障礙，如ATP的生成改變，膜電位的改變以及ROS的生成改變等，從而最終導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)僅僅是對(duì)糖尿病大鼠心肌Drp1的表達(dá)及定位進(jìn)行了初步研究，并未對(duì)其進(jìn)行深入研究，這也導(dǎo)致了本研究具有一定的局限性。因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們將在后續(xù)研究中，對(duì)Drp1在糖尿病心肌病中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制進(jìn)行更深層次的研究與探討，以期為糖尿病心肌病的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。

(本文圖1～3見(jiàn)封三)

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Expression of Drp1 in heart of diabetic mice

JingZhe*,LiuFengzhou,ChenYongqing,LiuYan,ChenChong,JingCe

(*DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegion，Lanzhou730050，China)

Objective To observe the expression of Drp1 in the cardial muscle tissue of diabetic mice and normal mice.Methods Nine male db/db mice were randomly divided into 3 groups(db/db 6week group, db/db 12week group and db/db 18week group). Nine male normal mice were randomly divided into another 3 groups(wt 6week group, wt 12week group and wt 18week group). The expression of Drp1 was detected by real-time PCR, Western Blot and immunohistochemical. Results Compared to the normal group, the expression of Drp1 was decreased obviously in db/db mice group, and was gradually decreased with age. Conclusions The decreased expression of Drp1 maybe is one of the possible mechanisms of diabetic cardiomyopathy.

Diabetes mellitus,type 2；Myocardium；Dynamin I ；Mitochondria,heart；Mice inbred DBA

荊哲，醫(yī)師，Email：35082774@qq.com

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.022

2016-01-04)