王聲翔，馮大敏，潘志云，王大江，韋世強(qiáng)

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)國(guó)家同步輻射實(shí)驗(yàn)室

生命細(xì)胞微觀世界的觀察和探索
——TXM顯微成像

王聲翔，馮大敏，潘志云，王大江，韋世強(qiáng)

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)國(guó)家同步輻射實(shí)驗(yàn)室

生命世界是非常神奇的，并令人震撼。自從人類進(jìn)化到會(huì)出使用工具的技能，就永不停止地對(duì)生命活動(dòng)進(jìn)行探索和研究。隨著科技的進(jìn)步和文明的發(fā)展，對(duì)生命的研究也逐步從觸手可及的宏觀世界進(jìn)入未知的微觀世界。眾所周知，細(xì)小到微米尺度的細(xì)胞是生命組成的基本單位，各種不同的細(xì)胞聚集在一起，再通過(guò)復(fù)雜有規(guī)律地的連接聚集成一個(gè)鮮活的生命體。生命就象像是一部獨(dú)特精密的“機(jī)器”，能說(shuō)會(huì)動(dòng)卻也有生銹的時(shí)候，有獨(dú)特的思想和性格卻也總會(huì)發(fā)生變化。顯微成像就是能直接觀察生命細(xì)胞的一種技術(shù)，它在生命科學(xué)和生命技術(shù)的進(jìn)步中一直發(fā)現(xiàn)和見(jiàn)證生命的奇跡。

在人類認(rèn)識(shí)生命細(xì)胞及其活動(dòng)的過(guò)程中，顯微鏡一直是科學(xué)家觀察微觀生物世界的眼睛。1665年羅伯特·胡克，第一次用顯微鏡發(fā)現(xiàn)了植物細(xì)胞。自此，科學(xué)家通過(guò)對(duì)光學(xué)顯微鏡的改良和使用，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他生物體細(xì)胞的存在，觀察到細(xì)胞分裂現(xiàn)象，建立了細(xì)胞學(xué)說(shuō)，也論證了整個(gè)生物界在結(jié)構(gòu)上的統(tǒng)一性以及生命在演化上的共同起源。1931年，恩斯特·魯斯卡和克斯·克諾爾研制了世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡，并最先應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。由于電子顯微鏡具有高分辨能力，可以看見(jiàn)細(xì)胞中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及發(fā)現(xiàn)病毒。在后續(xù)研究中幾乎所有致病病毒的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)證都依賴于電子顯微成像技術(shù)的運(yùn)用，如1970年英國(guó)學(xué)者戴恩等在電子顯微鏡下觀察到的乙肝病毒顆粒。這些在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的探索，每一次新發(fā)現(xiàn)都是激動(dòng)人心的，無(wú)疑對(duì)疾病的診斷和防治提供了非常重要的依據(jù)。

電子顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展，使我們可以看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)部未知的世界。然而還有很多艱難的科學(xué)任務(wù)擺在我們面前，現(xiàn)代生物學(xué)研究對(duì)納米分辨顯微成像技術(shù)也提出了更高的要求。毫無(wú)疑問(wèn)，三維成像技術(shù)的實(shí)現(xiàn)是顯微成像技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)之一。對(duì)于細(xì)胞而言，三維成像技術(shù)無(wú)論在對(duì)細(xì)胞本身定性定量的分析還是在成果說(shuō)明與知識(shí)傳播中都有重大的意義。如今，各類光學(xué)顯微鏡因?yàn)槭芟抻谘苌錁O限，空間分辨率低，難以看清亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；而電子顯微鏡受限于電子的低穿透力，只能對(duì)先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行切片，然后每張薄片分別進(jìn)行成像，拼湊出三維圖像。這個(gè)過(guò)程在操作上十分困難，并且切割細(xì)胞無(wú)疑會(huì)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可挽回的傷害，造成信息的缺失。

透射X射線顯微鏡（Transmission X-ray Microscope,TXM）的出現(xiàn)為顯微成像開(kāi)辟了一條全新的路徑。由于X射線的波長(zhǎng)遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)，X射線成像的空間分辨能力遠(yuǎn)強(qiáng)于可見(jiàn)光成像；同時(shí)X射線具有很強(qiáng)的穿透能力，可以穿透完整的細(xì)胞。TXM成像時(shí)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)，系統(tǒng)采集從0°到180°包含X射線衰減信息的二維投影圖像，最后利用CT重建技術(shù)，完成對(duì)完整細(xì)胞的高分辨無(wú)損三維顯微成像，這無(wú)疑對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的研究有巨大的推動(dòng)作用。

圖1 細(xì)胞軟X射線成像三維渲染圖

其中，能量范圍在284～543 eV之間的軟X射線具有特殊的物理性質(zhì)。此時(shí)，蛋白質(zhì)等生物樣品對(duì)X射線的吸收系數(shù)比水對(duì)X射線的吸收系數(shù)高一個(gè)數(shù)量級(jí)。利用這一天然的優(yōu)勢(shì)，軟X射線可以對(duì)含水細(xì)胞進(jìn)行成像研究，軟X射線“水窗”成像也因此得名。2004年美國(guó)ALS同步輻射光源C.A.Larabell研究小組，使用軟X射線透射顯微鏡首次對(duì)5微米的完整含水酵母細(xì)胞實(shí)現(xiàn)60納米分辨的三維成像(圖1)，獲得了細(xì)胞核、液泡、囊泡等幾種重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息。為此，著名的成像專家David Attwood在2006年Nature 442,642-643上發(fā)表評(píng)論指出：“納米分辨CT時(shí)代已經(jīng)到來(lái)”。

圖2 正常肝細(xì)胞和乙肝病毒感染后肝細(xì)胞X射線對(duì)照?qǐng)D

隨著設(shè)備的改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新，軟X射線三維顯微成像在細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要性日益顯著，西班牙科學(xué)家利用冷凍軟X射線成像對(duì)乙肝病毒感染細(xì)胞(ACS Nano 2016,10,6597?6611)。這一生物學(xué)問(wèn)題進(jìn)行研究。如圖2所示A、E分別是光學(xué)顯微鏡下的正常肝細(xì)胞和被感染的肝細(xì)胞。B、F是經(jīng)過(guò)重構(gòu)后的一些列軟線三維成像圖中的一張截面圖，C、G分別是B、F區(qū)域位置的三維渲染圖。實(shí)驗(yàn)樣品不需要任何染色和化學(xué)試劑固定處理，即可清晰的觀察細(xì)胞受感染前后亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

硬X射線是指能量范圍在1keV到十幾keV的X射線。由于硬X射線穿透能力很強(qiáng)，細(xì)胞完全被穿透對(duì)X射線吸收較少，以至于采集的細(xì)胞吸收投影圖像襯度較低，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重金屬染色來(lái)增加吸收襯度。圖3是我們?cè)谟瞂射線透射顯微鏡下對(duì)30微米尺寸大小的水稻花粉進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析的三維分割渲染圖，據(jù)此可分辨出花粉線粒體、油滴、液泡、細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分別用藍(lán)色、綠色、黃色和黑色標(biāo)記。

圖3 水稻花粉細(xì)胞三維渲染圖

雖然軟X射線和硬X射線顯微成像都可以進(jìn)行細(xì)胞三維成像研究，但是由于其本身的物理性質(zhì)，使其各自都有較為明顯的實(shí)驗(yàn)限制。軟X射線透射顯微鏡可以對(duì)自然狀態(tài)細(xì)胞進(jìn)行成像研究，最真實(shí)的解析細(xì)胞內(nèi)的秘密，但是軟X射線成像的焦深比較小，難以對(duì)直徑10微米以上的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞的納米分辨三維成像。硬X射線透射顯微鏡具有很大的焦深，可以對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞成像，但是吸收襯度較低，必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色等處理以提高襯度，樣品處理的難度較大，且會(huì)在一定程度上破壞細(xì)胞的自然狀態(tài)。迄今為止，對(duì)大多數(shù)含水細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行完整的納米分辨三維成像，仍然是一個(gè)懸而未決的世界性難題。我們課題組向著繪制細(xì)胞圖譜的前進(jìn)方向，從X射線成像理論和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)兩個(gè)方向努力研究，發(fā)明了中能（2～2.5 keV）X射線澤尼克相襯顯微鏡。

中能（2～2.5 keV）X射線澤尼克相襯顯微鏡（圖4）是在改變能量適用范圍的前提下，在原來(lái)X射線透射顯微鏡中引入澤尼克相襯，主要是在物鏡波帶片下游放置相移環(huán)，用以提取樣品的相位襯度，將相襯信號(hào)轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)信號(hào)。中能X射線澤尼克相襯顯微成像方法將在細(xì)胞納米分辨三維成像中發(fā)揮難以替代的作用。

首先，中能（2～2.5 keV）澤尼克相位襯度與“水窗”范圍內(nèi)的吸收襯度相當(dāng)，對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有很高的分辨能力。其次，由于軟X射線的穿透能力很弱，輻射劑量隨細(xì)胞尺寸的增加而急劇上升。對(duì)于520 eV的軟X射線，當(dāng)細(xì)胞大小為5微米時(shí)，輻射劑量?jī)H有3.16×107Gy；當(dāng)細(xì)胞大小增加到20微米時(shí)，輻射劑量急劇增加到8.77×109Gy，是5微米大小細(xì)胞的277倍！在中能（2～2.5 keV）附近，輻射劑量隨細(xì)胞尺寸的變化非常不敏感。尺寸為5微米的細(xì)胞，輻射劑量?jī)H僅為8.75×106Gy。隨著細(xì)胞尺寸增加到20微米，輻射劑量也只有1.1×107Gy。進(jìn)一步的計(jì)算表明，即使細(xì)胞尺寸增加到40微米，輻射劑量也只有2.5×108Gy，不會(huì)對(duì)冷凍細(xì)胞樣品造成明顯的結(jié)構(gòu)和功能損傷。這是因?yàn)?.5 keV中能X射線在20-40微米尺寸細(xì)胞中具有相當(dāng)高的透過(guò)率。最后，與“水窗”軟X射線顯微鏡相比，中能X射線澤尼克相襯顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是其擴(kuò)展的焦深，在30納米空間分辨率下，中能X射線顯微鏡具有15～25微米的焦深。這么大的焦深能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)更多種類的完整真核細(xì)胞的三維斷層成像，擴(kuò)大了TXM在細(xì)胞成像上的應(yīng)用空間，非常適合于完整真核細(xì)胞的納米分辨三維結(jié)構(gòu)成像。獲得細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的三維空間分布信息，將成為繪制細(xì)胞圖譜的重要利器，對(duì)生物學(xué)研究的意義十分重大。

探索未知生命世界的腳步永不停歇，顯微技術(shù)的發(fā)展如同科學(xué)巨人的手臂，不可或缺。21世紀(jì)我們的使命嚴(yán)峻且神圣，努力終究會(huì)獲得成就，探索終究會(huì)發(fā)現(xiàn)奇跡。讓我們共同去見(jiàn)證生命世界的神奇，為人類發(fā)展貢獻(xiàn)出一份微薄之力。

圖4 中能X射線澤尼克相襯顯微鏡

王大江，博士，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)國(guó)家同步輻射實(shí)驗(yàn)室職工。主要研究領(lǐng)域：X射線成像理論及應(yīng)用，計(jì)算機(jī)數(shù)值模擬和圖像處理等。

王大江。