李秀影

（吉林工程技術(shù)師范學院，長春 130052）

紫外線誘變對平菇菌絲體生長代謝影響的研究

李秀影

（吉林工程技術(shù)師范學院，長春 130052）

通過紫外誘變的方法研究不同時間紫外誘變對平菇菌絲體生長量、干物質(zhì)重量、可溶性蛋白質(zhì)含量，以及其對菌絲體生長過程中產(chǎn)生的代謝酶活力的影響，結(jié)果表明：當紫外誘變時間達到5min時，平菇長勢最好，干物質(zhì)重量達2.01g，而且菌絲體中的可溶性蛋白含量最高（3.09μg/g）。與此同時菌絲體在代謝過程中產(chǎn)生的纖維素酶和超氧化物歧化酶（SOD酶）活力均有顯著性提高，與對照相比誘變后纖維素酶的活力提高1.887倍，SOD酶的活力提高了1.29倍。在此基礎(chǔ)上進行的遺傳穩(wěn)定性試驗表明：平菇菌絲體經(jīng)過5min誘變后纖維素酶的活力達1.7～1.9倍，SOD酶活力提高了1.2～1.5倍。得出平菇菌絲體經(jīng)紫外誘變后能夠育選出長勢更旺，代謝酶活力更強的平菇菌種，為平菇優(yōu)良菌種的選育奠定了理論基礎(chǔ)。

平菇；紫外線誘變；菌絲體生長；菌絲體代謝

平菇（Pleurotus ostreatus）又名側(cè)耳，是一種味道鮮美、營養(yǎng)豐富、藥用價值高的食用菌，其在生物分類學中隸屬于真菌門，擔子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬。平菇中的氨基酸種類齊全，此外還含有硒、多糖體、礦物質(zhì)及維生素等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有改善人體新陳代謝，增強體質(zhì)，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能等作用。此外，功能性硒和多糖體還具有抗腫瘤的作用。由于生產(chǎn)過程中平菇的栽培方式比較粗放，菌種在培養(yǎng)料中易出現(xiàn)菌絲生長慢、營養(yǎng)物質(zhì)消耗快、易感染雜菌、菌糠綜合利用率低和工業(yè)開發(fā)種類相對較少等問題，導致平菇產(chǎn)量高和生長周期短的優(yōu)勢不能被明顯的體現(xiàn)出來，從而導致平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到制約。

針對上述問題利用紫外誘變育種技術(shù)，通過不同的紫外誘變時間考察誘變后平菇菌絲體的生長量、顏色、蛋白質(zhì)含量及誘變后代謝酶與對照組菌絲的變化，旨在為平菇的誘變育種提供理論依據(jù)，并為開發(fā)生長周期短，產(chǎn)量高，菌糠利用高的平菇菌種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種預培養(yǎng)、紫外誘變及菌種擴大培養(yǎng)

平菇菌種黑平1號由吉林農(nóng)業(yè)科技學院食用菌研究所提供。將黑平1號菌種轉(zhuǎn)接到PDA綜合培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。待菌絲體滿管后將其分別轉(zhuǎn)入配置好的固體PDA綜合培養(yǎng)基中。將長勢良好的母種接種到平板PDA綜合培養(yǎng)基中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行紫外誘變處理。紫外燈（15W）距平板的距離為30cm，照射時間分別為1、3、5、7、9min，每個處理有3個重復，并同時設(shè)置一個空白組。誘變結(jié)束后，迅速用牛皮紙將平板包裹好倒置（防止光復活），25℃避光培養(yǎng)4d，每24h觀察并記錄菌絲體的生長狀況。

取誘變后的平板菌絲體2mm×2mm接種到液體PDA綜合培養(yǎng)基中進行菌種擴大培養(yǎng)。在25℃恒溫，轉(zhuǎn)速180rpm的恒溫搖床中進行液體搖瓶培養(yǎng)7d。

1.2 纖維素酶的提取與測定

1.2.1 纖維素酶液的提取 將培養(yǎng)7d的發(fā)酵液在4℃、5000r/min的冷凍離心機中進行離心20min。取10mL離心后所得的上清發(fā)酵液與20mL 80%硫酸銨飽和溶液均勻混合，使之充分反應2h后在4℃、5000r/min條件下離心20min，以除去雜質(zhì)蛋白。將離心所得上清液緩慢加入80%飽和的硫酸銨溶液中，待產(chǎn)生沉淀后在相同的條件下離心20min，將所得的沉淀物透析20h。將Tris-鹽酸緩沖液添加到透析后的酶液中，在4℃、5 000r/min條件下離心20min，收集上清液。并重復上述清洗步驟三次，將所得的上清液混合即為粗酶液。

1.2.2 葡萄糖（G）標準曲線的制作 按表1向各編號試管中添加相應的試劑，配制不同濃度的標準液。搖勻后向各試管中添加1.5mL DNS溶液，并在沸水浴中反應5min。待反應結(jié)束后取出試管，冷卻后用蒸餾水定容至20mL，充分混勻，待測。以1號試管溶液為空白溶液調(diào)零，在540nm波長下測定各吸光度值（A）。以葡萄糖含量（μg）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得葡萄糖標準曲線，見圖1。

表1 葡萄糖標準液

圖1 葡萄糖標準線

1.2.3 纖維素酶活力測定—3，5-二硝基水楊酸法取6組（每組3支）20mL潔凈干燥的具塞試管，其中第1組試管為空白試管，添加未經(jīng)紫外誘變的纖維素酶液0.5mL，2~6組試管分別添加不同紫外誘變時間后提取的纖維素酶液0.5mL。此外按照編號，分別添加0.05mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液1.5mL。添加完畢后立即向1組試管添加1.5mL DNS溶液以終止酶液反應，充分搖勻后沸水浴中放置5min，冷卻用蒸餾水定容至20mL。將其它5組試管同時放在50℃的水浴中加熱10min后分別加入50mg濾紙條（新華定量濾紙），并在水浴中保溫1h。取出后，立即分別添加DNS溶液1.5mL以終止酶液反應，充分搖勻后沸水浴中放置5min，待冷卻后用蒸餾水定容至20mL。在540nm波長下測定各試管中溶液的吸光度值（OD 540nm），并記錄結(jié)果。

根據(jù)吸光度值，在標準曲線上查出相對應的葡萄糖含量，按公式1計算黑平1號的濾紙纖維素酶活力（U/g）。一個酶活力單位（U）指每小時由底物生成1mol葡萄糖所需要的酶的量。

1.3 超氧化物歧化酶（SOD）的提取與測定

1.3.1 超氧化物歧化酶的提取 將三角瓶中的菌絲球在4℃、5 000 r/min條件下離心20min后取菌絲球，加入3倍體積的磷酸緩沖溶液，浸泡30min后用六層紗布過濾。再將菌渣在緩沖液中浸泡30min，過濾，如此3次并收集3次所獲的濾液。稱量酶液的體積后，將氯仿和乙醇以3:5的體積混合后以1/4的體積加入酶液中，攪拌15min，棄去沉淀，將上清液靜置10min后測定SOD酶的活力。

1.3.2 超氧化物歧化酶活力的測定—鄰苯三酚自氧法 取6支試管，按表3順次加入試劑，迅速搖勻后在325nm波長下每隔30s測定一次吸光度值（A 325nm），觀測4min中內(nèi)吸光度值的變化。此過程中應保證自氧化速率控制在每分鐘0.07（可通過調(diào)節(jié)鄰苯三酚的量控制自氧化速率的改變）。

表3 鄰苯三酚自氧化速率測定試劑表

1.3.3 發(fā)酵液中超氧化物歧化酶活力測定 將不同處理的酶液在25℃水浴中預熱20min后加入到6支樣品管中，隨后按表4添加所需的反應試劑，其它反應步驟與1.3.2方法相同。

表4 SOD酶活力測定

SOD活力計算如公式2。

1.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

根據(jù)上述實驗結(jié)果可以得到誘變后濾紙纖維素酶活力和超氧化物歧化酶活力最強的菌絲體，對該菌絲體進行培養(yǎng)，提取和活力測定，進一步的考察黑平1號在此紫外誘變時間內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變對纖維素酶活力的影響

平菇屬于木腐生菌類，因此可利用纖維質(zhì)的植物殘體作為碳源供菌絲體和子實體生長。在生長過程中平菇本身所產(chǎn)生的纖維素酶能有效的加速其本身對碳源的利用，因此纖維素酶活力的強弱決定其生長勢[9]。從表4可以看出，隨著誘變時間的延長，纖維素酶的活力達最高點后出現(xiàn)下降的趨勢，在5min時其纖維素酶活力最強，是對照組纖維素酶活力的1.887倍。

表4 紫外線照射對纖維素酶活力的影響

2.2 紫外誘變對超氧化物歧化酶活力的影響

氧自由基在細胞內(nèi)過多的出現(xiàn)種可引發(fā)多種疾病，如腫瘤、衰老、血液病等，而超氧化物歧化酶具有消除自由基的作用，在一定程度上可以預防腫瘤的出現(xiàn)并延緩衰老。平菇能夠有效的抑制腫瘤也與過氧化物歧化酶有關(guān)。由表5可以看出，不同紫外誘變時間和在一定程度上提高評估中超氧化物歧化酶的活力，在5min中時其活力最強。

表5 紫外誘變對SOD活力的影響

2.3 遺傳穩(wěn)定性試驗中纖維素酶和SOD酶活力的測定

誘變育種是增加菌種突變幾率的一種物理育種方法，在育種過程中可同時得到所需的優(yōu)勢菌種和部分劣勢菌種，此后使優(yōu)良菌種的優(yōu)勢基因穩(wěn)定遺傳就可能得到我們所需的高產(chǎn)、抗逆性強、生長周期短、所需成分突出的菌株。而遺傳穩(wěn)定性是保持優(yōu)選菌種能夠推廣使用的理論基礎(chǔ)，本試驗針對紫外誘變5min時所獲得的菌株進行了兩種關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性試驗。

2.3.1 遺傳穩(wěn)定性中纖維素酶活力 黑平1號在紫外下誘變5min后所得的3組菌絲體中纖維素酶的活力如表6。

表6 紫外誘變5min后纖維素酶活力穩(wěn)定性測定

表6結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5min紫外誘變的黑平1號菌種的纖維素酶活力與未經(jīng)紫外誘變的菌種有顯著的提高，為其1.83±0.063倍。

2.3.2 遺傳穩(wěn)定性中超氧化物歧化酶活力測定黑平1號在紫外誘變5min中時所得的3組菌絲體中超氧化物歧化酶的活力如表7。

表7 紫外誘變5min后超氧化物歧化酶活力穩(wěn)定性測定

表7結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5min紫外誘變的黑平1號菌種的超氧化物歧化酶的活力與未經(jīng)紫外誘變的菌種有顯著的提高，為其1.39±0.143倍。

3 結(jié)論與討論

本文通過紫外誘變技術(shù)對優(yōu)質(zhì)菌株黑平1號進行誘變試驗，試驗表明黑平1號兩種重要的酶——纖維素酶和超氧化物歧化酶在誘變時間為5min中時，較未誘變的菌株都表現(xiàn)出更優(yōu)的酶活力。誘變時間為1min的菌株對纖維素酶活力有一定的抑制作用，而其它誘變時間對兩種酶的活力都有不同程度的提高，可見其在相對短的時間內(nèi)的誘變是不利誘變，致使某些優(yōu)良特性降低。這可能與誘變后基因片段不能及時恢復或誘變處理不徹底有直接的關(guān)系。

本試驗就上述結(jié)果又進行了誘變遺傳穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明其酶活力分別提高了1.83±0.063倍和1.39±0.143倍。證明其遺傳具有一定的穩(wěn)定性，可以作為后期育種的理論基礎(chǔ)。由于菌絲體纖維素酶活力的增強有望使菌糠的利用率提高，減少了副產(chǎn)物后期加工的難度，并為其綜合利用提供了可能。

盡管如此，本實驗仍存在一定的局限性，本試驗并未對黑平1號的全株特點進行評估，其它活性物質(zhì)的變化趨勢也是評價優(yōu)質(zhì)菌株的重要指標，此外，在后續(xù)工作中應繼續(xù)對菌絲體的出菇水平進行測試，以確保我們所選的菌株為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的菌株。因此菌株的生物學活性物質(zhì)測定及營養(yǎng)測定還有待于進一步的研究。

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責任編輯：建德鋒

A Study on the Growth and Metabolism of P.ostreatus Mycelium by UV Mutation

LI XiuYing
(Jilin Teachers′Institute of Engineering and Technology，Jilin，130052)

This paper focuses on the effect of different period of UV mutation time(1，3，5，7，9 min)on the growth and metabolism of P.ostreatus mycelium.The results showed that when the UV mutation time reached at 5 min，not only the mycelium’s growth vigor was the best and the dry，weight could achieve 2.01g but also the content of soluble protein of mycelium was the highest(3.09μg/g).What’s more，the cellulase and superoxide dismutase(SOD)were improved significantly during the metabolic process.Compared with control，after 5min UV radiation the cellulase activity and superoxide dismutase increased to 1.887 and 1.29 times，respectively.The genetic stability test indicated that，after 5 min ultraviolet mutation，both of cellulase activity and superoxide dismutase activity were increased to 1.7~1.9 and 1.2~1.5 times，respectively.The results proposed that UV mutation breeding technology could select better mycelium，which growth vigor was stronger and metabolic enzymes’activity was better than the one that was without UV radiation.It could provide a theoretical principle for future study on P.ostreatus.

P.ostreatus;UV mutation;growth of mycelium;metabolism of mycelium

S646.14

A

2016-07-18

李秀影（1964-），女，吉林省九臺縣人，中教高級，從事食品科學方面的教學與科研。