李 蘭 ， 鄭其升 ， 付言峰 ， 肖希龍 ， 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所 ， 江蘇南京210014 ； 2.國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心 ，江蘇南京210014 ； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

幾種膠原樣凝集素的生物學(xué)特性及其抗病原微生物的作用

李 蘭1，2， 鄭其升1，2， 付言峰1， 肖希龍3， 侯繼波1，2

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所 ， 江蘇南京210014 ； 2.國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心 ，江蘇南京210014 ； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

1 膠原樣凝集素概況

膠原樣凝集素屬于脊椎動(dòng)物C-型凝集素超家族，具有相似的分子結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體由N末端區(qū)域、膠原樣區(qū)域(CollagenLikeRegion，CLR)、起連接作用的莖區(qū)和碳水化合物識(shí)別區(qū)域(Carbo.hydrateRecognitionDomain，CRD)等4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[1]，單體之間形成同源三聚體，三聚體單元會(huì)進(jìn)一步組合成為多聚體形式，不同的膠原樣凝集素其三聚體單元數(shù)目是不同的。凝集素自發(fā)現(xiàn)至今逐漸引起各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注，其CRD結(jié)構(gòu)域已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，化學(xué)家著眼于其糖識(shí)別的分子機(jī)制，免疫學(xué)家則集中于CRD的天然免疫功能，如調(diào)理吞噬、補(bǔ)體激活及炎癥反應(yīng)等[2]，近幾年越來(lái)越多的研究證明，凝集素還具有中和病原微生物包括病毒、細(xì)菌和真菌的生物學(xué)功能[3-6]。

關(guān)于凝集素抗微生物的研究，在人醫(yī)領(lǐng)域研究較多，而在獸醫(yī)領(lǐng)域研究相對(duì)較少。大量的臨床和動(dòng)物模型試驗(yàn)表明甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)或纖維膠凝蛋白(Ficolin)缺乏會(huì)增加機(jī)體對(duì)病原微生物的感染，利用基因敲除的方法構(gòu)建缺失上述膠原凝集素的小鼠模型是研究凝集素在體內(nèi)發(fā)揮作用的有效方法，如缺失1種或2種MBL的小鼠感染金黃色葡萄球菌，以野生型小鼠作為對(duì)照，結(jié)果顯示，感染48h，缺失MBL的小鼠全部死亡，而野生型小鼠有60%的存活率[7]，另外基因敲除鼠給予重組表達(dá)的人MBL，其存活率與野生型小鼠持平；缺失Ficolin A、Ficolin B和同時(shí)缺失兩種Ficolin的小鼠感染肺炎鏈球菌，結(jié)果顯示，其存活率顯著降低[8]，以上充分證明了MBL等凝集素在機(jī)體抵御病原微生物的重要作用。

本文將介紹甘露聚糖結(jié)合凝集素、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)和纖維膠凝蛋白等脊椎動(dòng)物膠原樣凝集素的中和微生物作用及其可能的作用機(jī)制，為抗微生物藥物的研發(fā)提供一種新的思路及方向。

2 中和微生物作用

2.1 MBL 有關(guān)人MBL的研究比較深入，MBL能夠中和流感病毒、胸膜肺炎放線桿菌、埃博拉病毒、HIV、立百病毒等。Kase等[9]于1999年報(bào)道了人MBL能夠直接抑制流感病毒的感染，研究采用蝕斑減少試驗(yàn)評(píng)價(jià)了用兩種不同方法制備的人MBL中和流感病毒的能力，結(jié)果顯示，從血清中提取的MBL和CHO細(xì)胞表達(dá)的MBL均能夠顯著降低流感病毒在MDCK細(xì)胞上的感染，0.125 μg/mLMBL抑制率達(dá)到50%，0.25 μg/mLMBL抑制率達(dá)到90%，1.0 μg/mL MBL抑制率甚至達(dá)到100%。

哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院一研究團(tuán)隊(duì)[7]對(duì)MBL抗微生物作用進(jìn)行了大量的研究，并且重組MBL已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)且于2006年已經(jīng)通過(guò)Ⅰ期臨床試驗(yàn)，但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，額外補(bǔ)充的MBL能夠在體內(nèi)引起一種副反應(yīng)，即干擾體內(nèi)血凝系統(tǒng)，臨床試驗(yàn)被迫停止。近幾年，該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)改造獲得了一些MBL的衍生物，具有MBL的活性同時(shí)不會(huì)干擾血凝系統(tǒng)。嵌合重組凝集素4(RCL4)用L-Ficolin的膠原樣區(qū)域代替MBL的膠原樣區(qū)域，而獲得，在抗感染方面(流感病毒、埃博拉病毒和立百病毒)有更優(yōu)越的表現(xiàn)，在體內(nèi)激活凝集素的作用是MBL的10倍以上，同時(shí)激活類凝血酶活性的副作用大大減小。

2.2 SP-A、D 現(xiàn)有研究顯示SP-A、D能夠中和流感病毒，能夠與不同亞型的流感病毒結(jié)合，且SP-D抗流感病毒作用表現(xiàn)的更優(yōu)越[5，10-11]。Marine等[5]研究了豬SP-D作為一種抗流感病毒藥物的潛在應(yīng)用價(jià)值，血凝抑制試驗(yàn)評(píng)價(jià)了包括H1N1、H3N2、H5N1等在內(nèi)的30株流感病毒與豬SP-D的作用，結(jié)果顯示，SP-D以不同的親和力與不同亞型的流感病毒結(jié)合，進(jìn)一步研究顯示，豬SP-D能夠抑制流感A病毒(IAV)感染MDCK細(xì)胞，具有中和IAV的作用；Benne等[12]發(fā)現(xiàn)，人SP-A能夠直接作用于H1N1和H3N2亞型流感病毒；張峰等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HEK 293T細(xì)胞表達(dá)的重組豬SP-A蛋白能夠與PRRSV進(jìn)行結(jié)合，且能夠降低在Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞的感染，表明豬SP-A具有抗PRRSV的活性；另有研究顯示，SP-A能夠抵抗1型單純皰疹病毒、肺炎肺囊蟲、真菌煙曲霉分生孢子、呼吸道合胞體病毒、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸桿菌J5、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、A族和B族鏈球菌等的感染；SP-D也有相似的抗微生物譜。

2.3 Ficolin Ficolin對(duì)病原微生物的直接作用也有報(bào)道，Keirstead等[3]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icolin及重組Ficolin能夠與PRRSV結(jié)合，并且采用蝕斑減少試驗(yàn)比較了從豬血清中提取的Ficolin及在細(xì)胞中表達(dá)的Ficolin中和PRRSV的作用，結(jié)果顯示，兩者都能夠中和PRRSV，不過(guò)前者作用更強(qiáng)，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icolin能夠與沙門菌和胸膜肺炎放線桿菌結(jié)合；Michalski等于2015年首次證實(shí)，人H-Ficolin能夠抵抗蜂房哈夫尼菌的感染；還有研究顯示，人L-Ficolin能夠與A型流感病毒結(jié)合，進(jìn)而抑制其進(jìn)入MDCK細(xì)胞，發(fā)揮直接抗病毒作用，另外Ficolin還能夠與大腸桿菌、沙門菌、福氏志賀菌、粘質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌等等革蘭陰性菌結(jié)合，且能夠與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌革蘭陽(yáng)性菌結(jié)合。

3 抗微生物作用機(jī)制

多個(gè)研究結(jié)果表明，凝集素是通過(guò)阻斷病毒的吸附或細(xì)菌等粘附而發(fā)揮作用的，尤其關(guān)于抗病毒的作用機(jī)制研究較多。Keyaerts等[6]發(fā)現(xiàn)HHA，一種來(lái)源于植物的甘露糖凝集素，主要作用于病毒的吸附階段，當(dāng)病毒與細(xì)胞在4 ℃孵育時(shí)，病毒僅發(fā)生吸附作用而不能內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞，HHA的EC50為 2.5 μg/mL，但當(dāng)病毒與細(xì)胞在37 ℃孵育時(shí)，病毒即發(fā)生吸附作用又能內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，此時(shí)HHA的EC50為5.2 μg/mL；另有Marine等[5]人的研究成果顯示，重組表達(dá)的SP-D能夠100%阻斷H1N1和H3N2的吸附，但該研究并沒(méi)有進(jìn)一步研究SP-D對(duì)病毒內(nèi)化的影響，也許認(rèn)為SP-D能夠完全阻斷病毒的吸附，再進(jìn)行病毒內(nèi)化試驗(yàn)已經(jīng)沒(méi)有意義；還有很多文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)阻斷HIV和HCV進(jìn)入靶細(xì)胞而發(fā)生抗病毒作用的多種凝集素，如來(lái)源于哺乳動(dòng)物的MBL、DC-SIGN、SP-D等、來(lái)源于原核生物的Scytovirin、來(lái)源于海洋珊瑚的Gerardia savaglia、種類豐富的植物凝集素HHA和GNA、來(lái)源于無(wú)脊椎動(dòng)物的Chaetopterus variopedatus[13]。

大量研究資料顯示，微生物表面糖基在病毒吸附的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如HIV的gp120和gp40糖蛋白[14]、HCV的E1和E2糖蛋白[15]、IAV的HA和NA糖蛋白[14]、SARS-CoV的S和ACE2糖蛋白等[14，16]。SP-A可與呼吸道合胞病毒表面的F(融合)糖蛋白結(jié)合，從而抑制F蛋白的融合功能，進(jìn)而抑制病毒入侵[17]其次：Marine研究結(jié)果證明，SP-D能夠和流感病，毒表面的HA相互作用，阻止病毒附著到靶細(xì)胞而發(fā)揮病毒中和的作用[5]；此外，一些來(lái)源不同的凝集素如SP-D、植物凝集素已被證實(shí)可以與HIV表面的糖蛋白gp120和gp40結(jié)合，與凝集素結(jié)合后的HIV可能由于空間位阻的原因不能與受體蛋白CD4CXCR4或CCR5結(jié)合，從而阻斷HIV進(jìn)入靶細(xì)胞而降低感染率[1，18]，綜上所述，凝集素很可能通過(guò)與病原微生物表面的糖蛋白中的一種或幾種結(jié)合，抑制了病毒靶細(xì)胞上的受體的識(shí)別及結(jié)合，從而阻斷了病毒的吸附過(guò)程。

4 結(jié)語(yǔ)

以微生物入侵作為作用靶點(diǎn)的抗微生物藥物有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅可以阻斷健康細(xì)胞的感染，還能阻斷感染細(xì)胞向健康細(xì)胞傳播病毒的途徑[13]，所以凝集素在人醫(yī)領(lǐng)域已被列為抗HIV的潛在藥物。同時(shí)與普通病毒入侵抑制劑相比，凝集素還能夠通過(guò)自身受體阻止HIV病毒向樹(shù)突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的傳播[19-20]，進(jìn)一步降低HIV在機(jī)體內(nèi)的傳播機(jī)會(huì)，因此凝集素作為一類新型抗微生物藥物越來(lái)越受到藥物開(kāi)發(fā)者的青睞。

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2016-4-19

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2013-03046)

李蘭(1983-)，女，博士生，主要從事新獸藥研究工作，E-mail：lanli99@foxmail.com

肖希龍，E-mail：xiaoxl@cau.edu.cn；侯繼波，E-mail：houjibo@jaas.ac.cn

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0076-03