許凱迪，陳鴻軍

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·綜述·

新型蝙蝠流感病毒研究進展

許凱迪，陳鴻軍

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

甲型流感病毒能感染多種宿主。最近，在蝙蝠中鑒定出流感病毒兩種新亞型：H17N10和H18N11，擴大了流感病毒宿主范圍。與已知毒株不同的是，這兩種蝙蝠病毒有著獨特的復制特性。進化分析表明，這兩種病毒在蝙蝠中長期獨立進化，血清學檢測陽性率極高。蝙蝠占已分類哺乳動物的20%，暗示有大量未定型的甲型流感病毒存在于這些龐大的隱形宿主中，其潛在流行可能性凸顯了這些新病毒的公共衛(wèi)生學意義。

流感病毒；H17N10；H18N11；公共衛(wèi)生；蝙蝠

甲型流感病毒（Influenza A virus）亞型眾多，在禽、豬和人群中流行和傳播的毒株具有重要的公共衛(wèi)生意義。甲型流感病毒可感染多種動物，包括：靈長類動物、狗、馬、貓、牛、海豹、鯨魚、豚鼠、雪貂、水貂、大熊貓、貍貓、食蟻獸、駱駝和企鵝等[1-3]。最近，在危地馬拉小黃肩蝙蝠（葉口蝠科黃肩蝠屬）和秘魯平臉果蝠（葉口蝠科牙買加果蝠屬）中發(fā)現(xiàn)可能存在H17N10和H18N11兩種新型的流感病毒[4,5]。

甲型流感病毒屬于正黏病毒科，基因組由8個節(jié)段的單股負鏈RNA組成，通過剪切拼接、移碼等機制，至少編碼14種病毒蛋白。流感病毒亞型分類依據兩種主要的表面蛋白：血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）。在鑒定出蝙蝠流感病毒（Bat Influenza virus, BIV）之前，已有16種HA亞型和9種NA亞型流感病毒被發(fā)現(xiàn)，主要存在于鳥類、水禽體內。在這些病毒中，只有H1N1、H2N2和H3N2可感染人類并引起大流行[6]。

1 概述

小黃肩蝙蝠的H17N10亞型流感病毒和平臉果蝠的H18N11亞型流感病毒是兩種全新的亞型，在進化上與其他流行毒株明顯不同[4,5,7]。通過RT-PCR對H17N10三個毒株的全基因組（A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/164/2009、A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/153/2009和A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/060/2010）和H18N11亞型的1株病毒全基因組（A/flat-faced bat/ Peru/033/2010）進行測序發(fā)現(xiàn)，這些新亞型基因組結構和可能編碼的蛋白與其他甲型流感病毒保持一致。H17N10 BIV最初發(fā)現(xiàn)于蝙蝠直腸樣本中，在肝臟、腎臟、小腸和肺臟組織中亦存在；而H18N11 BIV的RNA也最先發(fā)現(xiàn)于蝙蝠直腸樣本中。迄今為止，尚不能從這些動物中分離獲得傳染性的病毒粒子，但蝙蝠的腸道內存在著大量病毒基因組RNA，說明蝙蝠流感病毒在腸道內具有明顯組織嗜性，這一點更傾向于鳥類。而大多數哺乳動物中流感病毒主要感染呼吸道。1979～1982年，研究人員從蝙蝠體內分離了株甲型流感病毒（A/bat/Alma-Ata/73/1976），也發(fā)現(xiàn)了在蝙蝠體內有抗流感病毒特異性抗體[8-10]。然而，這株蝙蝠流感病毒與人H3N2病毒的特異性血清產生免疫反應，且蝙蝠血清可識別人類H2N2和H3N2病毒，顯然不同于從南美蝙蝠中發(fā)現(xiàn)的H17N10和H18N11新亞型病毒。

H17N10和H18N11病毒分離于不同種蝙蝠，間隔時間較久，相距3000多千米。但是這兩個亞型卻密切相關，并異于其他甲型流感病毒，同時，它們之間差異也相當大[4,5]，這說明這些病毒已存在一段比較長的時間。南美蝙蝠種群的血清陽性率較高，達到50%[5]，說明這兩種病毒感染很常見。然而，有研究檢測了1300多只歐洲中部的蝙蝠，并未發(fā)現(xiàn)任何流感樣病毒，說明并不是所有蝙蝠都易被感染[11]。因此，蝙蝠可能是一種遷徙病毒庫。

2 公共衛(wèi)生意義

流感病毒可通過病毒基因突變和整段基因重排機制實現(xiàn)病毒變異，并有效傳播給新的宿主，產生適應性復制。進化分析表明，H17N10和H18N11系譜非常古老。NA、內部基因節(jié)段（PB2、PB1、PA、NP、NS、M）與來自經典甲型流感病毒對應基因完全不同。H17和H18的HA與H1、H2、H5和H6亞型的HA比較接近。最初猜測是H17和H18的HA有密切聯(lián)系，特別是與蝙蝠流感病毒其他基因相比，暗示蝙蝠流感與禽流感HA基因發(fā)生重排[4]。然而，近年來對禽流感病毒內部基因進行了大量分析，與蝙蝠流感病毒的內源基因似乎并沒有太多相關性[7]。H17和H18亞型蝙蝠流感病毒是單獨進化而來，并未發(fā)生重組。這些病毒在蝙蝠以外傳播幾率不大，即便發(fā)生，也不太可能造成持續(xù)性感染。當然，現(xiàn)有認識還很有限，數據量尚小，仍需要進一步監(jiān)測確定蝙蝠流感病毒的分布規(guī)律，確定新的蝙蝠種類中能否分離出BIV，才能全面展示種間流感基因交換是否活躍存在。

跨種傳播和人畜共患存在兩種主要障礙：病毒入侵和基因組復制轉錄[12]。入侵主要通過HA調節(jié)，基因組復制轉錄是通過病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RDRP）完成。病毒RNA聚合酶是由PB2、PB1、PA組成，與病毒RNA和病毒核蛋白（NP）組成復合物來啟動轉錄、復制[13]。物種特異性的RDRP活性妨礙宿主間轉換，來自于禽流感病毒的RDRP在哺乳動物細胞上幾乎沒有功能[3,14,15]，可能是人類細胞中存在強有力的制約因素有選擇性失活禽源聚合酶[16]。PB2亞基的單一突變，即在627位由禽源谷氨酸殘基突變?yōu)槿嗽促嚢彼釟埢‥627K），能夠突破人類細胞的功能限制[14]。還有一些適應性改變，比如：第二位抑制子突變、PB2核定位序列改變、PA節(jié)段發(fā)生重排[17]。

蝙蝠病毒聚合酶蛋白和核蛋白（NP）具有保守的活性位點和許多關鍵的共性功能區(qū)。H17N10 BIV PA蛋白的N端結構表明，該區(qū)域包含一個核酸內切酶位點，跟其他PA基因一樣[18]。令人驚訝的是，蝙蝠流感PB2的第627位既不是賴氨酸也不是谷氨酸，而是其他病毒沒有出現(xiàn)過的絲氨酸殘基。盡管如此，蝙蝠流感聚合酶在人類和禽類細胞中活性卻非常高[4,5]。在禽流感病毒PB2引入蝙蝠流感樣S627突變，也能適應人類細胞。蝙蝠細胞能限制禽源病毒聚合酶活性，與禽源聚合酶PB2 E627在人類細胞上情況相同[19]。蝙蝠聚合酶和NP嵌合病毒能在多種哺乳動物高效復制，包括狗、豬、人類和蝙蝠[20]。蝙蝠聚合酶能很好地適應多種蝙蝠，這說明其在跨種傳播中并非必需。

那么，人類流感病毒和禽流感病毒能否感染蝙蝠呢？已有報道表明，來自于9種不同蝙蝠的15株細胞都容易感染人類流感病毒[19]。這些細胞來自于果蝠、蟲蝠等蝙蝠的多種組織，已構建成年蝙蝠及胚源細胞系。另外，這些細胞也可以感染禽類、豬、鼠適應毒[20,21]。乙型流感病毒也可以在蝙蝠細胞中復制[19]。蝙蝠細胞能共感染2種不同流感毒株，并能產生重組病毒[22]。然而，H17N10和H18N11 BIV的重組潛力可能是有限的，因為病毒基因和包裝信號與非蝙蝠流感病毒是不相容的[20]。由此可見，雖然包括我們在內的實驗室證明蝙蝠細胞可感染流感病毒，但在自然情況下卻不得而知[8-10,34]。若是可能，由此產生的重組病毒將改變宿主范圍，且致病性相對會更強。

3 HA功能

流感病毒HA參與粘附和入侵[23]。HA以三聚體形式鑲嵌在病毒子表面。HA在翻譯修飾時，在莖部切割成HA1和HA2兩個亞基。受體結合位點（receptor binding site，RBS）在HA1的球狀頭部，識別唾液酸受體粘附靶細胞表面，而HA2的功能主要發(fā)生在融合和入侵的過程。不同物種間不同的唾液酸受體結構是跨物種傳播的主要障礙之一。禽類主要存在α2, 3唾液酸，哺乳動物主要存在α2, 6唾液酸[23]。HA識別不同唾液酸的能力造成組織嗜性不同、宿主間傳播能力不同[24]。令人驚訝的是，對 H17和H18亞型BIV的HA（以下縮寫為：BHA）分析時，HA不能識別唾液酸受體、天然唾液酸苷和超過600種多聚糖[4]。此外，重組H17N10 BIV無法粘附MDCK細胞（富含多種多聚糖，通常用來增殖高效價的流感病毒[25]）。這并不是因為蝙蝠細胞上缺乏唾液酸受體，當用人源流感病毒進行感染時，證明這些細胞表面存在唾液酸[19]。

BHA與其他HA蛋白的同源性僅45%[4,25]，H17和H18的HA序列之間同源性也只有60%，但整體結構與其他流感病毒的HA三聚體結構相似，并能形成易于識別的球形頭部和莖部。HA的高度變異是選擇正壓所致，會引起免疫逃避[26]。BHA蛋白結構能幫助解釋為何不能結合唾液酸。BHA受體結合位點（RBS）的結構與經典HA的有明顯不同。經典的HA RBS形成一個淺結合穴，唾液酸兩側關鍵的結構要素有130-環(huán)、220-環(huán)和190-螺旋[27]。保守的芳香烴殘基構成穴底，環(huán)和螺旋的關鍵氨基酸形成結合穴的邊緣。穴邊緣氨基酸殘基差異導致了HA對不同唾液酸結構的識別差異。最近，在雪貂模型中，H5 HA這一區(qū)域的點突變與H5N1氣溶膠傳播直接相關[24]。然而，很多RBS邊緣的關鍵受體決定性殘基在BHA中并不保守。RBS幾個額外的殘基變化使該淺穴結構幾乎完全消失，可能嚴重影響受體結合特性。對接模型預測顯示：H17 HA RBS與唾液酸結構并不吻合[28]。BHA 130-環(huán)的136位天冬氨酸對唾液酸存在靜電排斥現(xiàn)象。HA三聚體的其他結構改變也可能影響功能和穩(wěn)定性，比如H17的HA莖部根部的融合肽不尋常地暴露在表面[25]。

4 NA功能

HA調節(jié)病毒吸附和入侵過程，而NA首要功能是參與病毒包裝和釋放。NA裂解存在于細胞或病毒顆粒表面的唾液酸，以防止HA結合感染細胞而導致的病毒粒子團聚。然而，蝙蝠流感病毒的NA似乎也不是典型的神經氨酸酶，因為無論是N10還是N11，對唾液酸酶底物或大量多聚糖并無作用[5]。

N10和N11蛋白復合體的晶體結構可解釋底物特異性的不同[4,5]。一般亞型的NA亞基組裝形成一種“盒狀”胞外域的四聚體，并利用跨膜區(qū)插入到病毒脂質囊膜中。胞外域具有酶活性。N10和N11具有相似的球狀結構，差異主要位于活性位點。一般在NA中參與底物結合和催化的殘基，在N10和N11中鮮有相同。此外，穩(wěn)定活性位點的二級折疊中的一些殘基也不保守。150-環(huán)和430-環(huán)導致活性部位的上移，擴大了底物結合范圍。出乎意料的是，在N10的150-環(huán)出現(xiàn)異常的鏈內互作，這在其他NA中不存在。

即便N10或N11的NA結構中形成比較大的結合袋，經典的唾液酸底物依然與該結合區(qū)不吻合[5,29,30]。神經氨酸酶抑制劑——奧司他韋與N1和N2活性位點結合，但卻不能與N10的活性位點區(qū)結合，這一現(xiàn)象也驗證了上述結論。相似的結構和可預測的不吻合亦存在于N11結構中[5]。變大的結合袋和150-環(huán)位置改變，這些對抑制劑結合有重要作用的影響因素[31]，不吻合導致神經氨酸酶抑制劑對蝙蝠流感病毒的NAs似乎并沒有抑制效果。迄今為止，N10和N11的底物尚不清楚。在其他流感病毒中，HA和NA分別具有受體結合酶和受體破壞酶活性，而對于H17和H18，底物很可能卻是一種尚未鑒定出的新型分子。抑或，蝙蝠流感病毒經過進化利用一種新型受體，而NA受體破壞酶活性可能就是多余的，而N10和N11可能在病毒復制期間發(fā)揮不同的作用。動物源，檢測自然狀況下蝙蝠感染的情況，對研究流感病毒的跨物種傳播方式有著重要的指導意義，而這些病毒是否對人類健康構成威脅則顯得更為重要。利用反向遺傳學技術拯救蝙蝠流感病毒將有利于解釋這些病毒的生物學特性和復制策略，尤其是研究BIV受體特性。雖然BIV的重組病毒還沒有拯救成功，但是通過BIV節(jié)段的末端反向重復區(qū)組裝成的H1N1流感病毒被成功拯救，使得這兩個新亞型的生物學特性以及復制能力有了顯著進展[32]。這些研究將揭示蝙蝠流感病毒是否在禽類和哺乳動物中產生遺傳多樣性。

5 NS1功能

NS1是流感病毒中最主要的多功能免疫抑制因子，在抗干擾素和其他多種先天性免疫途徑中發(fā)揮了重要調節(jié)作用。H17N10亞型蝙蝠流感病毒的NS1（以下縮寫為BNS1）替換PR8毒株的NS1，研究結果發(fā)現(xiàn)，重組BNS1的PR8抗干擾素活性顯著被增強[32]。Hannah等[33]最近研究也表明BNS1可結合雙鏈RNA，顯著抑制天然免疫反應。H17N10亞型蝙蝠流感病毒與其他A型流感病毒的NS1具有50%同源性，但BNS1卻極可能顯示出更強的免疫調節(jié)作用。我們最近的研究也表明，BNS1明顯具有抑制干擾素活性功能[34]。

6 展望

蝙蝠種類有1200多種，只有H17N10和H18N11兩種新型蝙蝠流感病毒被發(fā)現(xiàn)。似乎有可能可以分離獲得更多毒株，甚至可能還有其他亞型的甲型流感病毒[35]。同時，鑒定這些病毒是禽源或者是哺乳

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PROGRESSES ON NOVEL BAT INFLUENZA VIRUSES

XU Kai-di , CHEN Hong-jun

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Many hosts are susceptible to infuenza A virus infection. Recently, two novel subtypes of infuenza A viruses have been detected from bats, i.e. subtypes H17N10 and H18N11 of Bat Infuenza viruses (BIVs). Compared to other infuenza viruses, BIVs have unique replication features. From the analysis on virus evolution, novel infuenza viruses have been circulating in bats for a long time. A previous serology has detected a highly positive ratios in different bats. As a large number of bat species circulate in mammals (about 20 %), many unknown subtypes of Infuenza A viruses might replicate in bats. If these viruses have a potential to spread from bats to humans or other animals, the signifcance of public health will stand out as a big problem.

Infuenza virus; H17N10; H18N11; public health; bat

S852.659.5

A

1674-6422（2016）06-0075-06

2016-02-25

國家自然基金面上項目（31572502）；中央公益性單位專項經費（2015JB15）；中國農業(yè)科學院動物流感病毒病原生態(tài)學創(chuàng)新團隊專項經費

許凱迪，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

陳鴻軍，E-mail：vetchj@shvri.ac.cn