李 恒 ， 佘銳萍 ， 吳橋興 ， 石蕊寒 ， 胡鳳嬌 ， 李 威 ， 張 洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

?

恒河猴蠟樣芽孢桿菌感染引起腎病的病理診斷報告

李 恒 ， 佘銳萍 ， 吳橋興 ， 石蕊寒 ， 胡鳳嬌 ， 李 威 ， 張 洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

采用組織病理學(xué)、超微病理學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)合病原學(xué)檢測方法對北京某研究中心的病死恒河猴進行了觀察分析，結(jié)果表明，該恒河猴因蠟樣芽孢桿菌感染引起滲出性肺炎、腎病，最終因呼吸障礙而死亡。

恒河猴 ； 腎病 ； 蠟樣芽孢桿菌 ； 淀粉樣變

恒河猴是我們國家的二級保護動物，也是常見的實驗動物。與其他哺乳類實驗動物相比，恒河猴在生物進化上與人類更為接近，因而，被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、行為學(xué)、進化學(xué)等領(lǐng)域的研究[1]。國內(nèi)關(guān)于恒河猴疾病的報道并不多見，王衡[2]等曾經(jīng)報道過1例恒河猴感染肺結(jié)核的病理診斷報告，其他疾病還很少見有報道。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種在自然界中廣泛分布的好氣、中溫、產(chǎn)芽孢的桿菌，也是食品中常見的污染菌[3]。蠟樣芽孢桿菌作為條件致病菌，在機體處于正常免疫狀態(tài)下不具有致病性，而當(dāng)機體免疫力下降時，此細菌能夠引發(fā)腦膜炎、肺炎或敗血癥[4]。

本文報道了1例因蠟樣芽孢桿菌感染引起恒河猴急性肺炎和腎病的死亡病例，對其病理變化特點、細菌分離培養(yǎng)鑒定進行了觀察和描述，為進一步防止此類疾病的發(fā)生，保護恒河猴的健康提供借鑒與參考。

1 病例簡介

2015年1月由北京某大學(xué)實驗動物研究中心送檢病死恒河猴1只，4歲，雄性，病程2 d，死亡前半天口角流血，呼吸急促，精神不振。

2 材料與方法

2.1 取材 取恒河猴內(nèi)臟器官于25 mL/L 戊二醛-多聚甲醛混合液充分固定后，常規(guī)方法制成石蠟切片，分別進行H.E.染色，剛果紅染色，甲基紫染色，PAS染色，Mallory三色染色。重點觀察心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脾臟的病理學(xué)變化，OLYMPUS顯微鏡拍照。

2.2 染色方法

2.2.1 H.E.染色按常規(guī)染色方法進行。

2.2.2 剛果紅染色 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)Harris 蘇木精染色10～15 min，自來水沖洗數(shù)分鐘；(3)1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，溫水顯藍，自來水沖洗數(shù)分鐘；(4)甲醇剛果紅染色15 min，自來水沖洗數(shù)分鐘；(5)0.2%堿性乙醇分化數(shù)秒鐘，自來水沖洗；(6)常規(guī)脫水、透明、封片；(7)顯微鏡觀察，淀粉樣物質(zhì)呈磚紅色。

2.2.3 高錳酸鉀-剛果紅染色(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)5%高錳酸鉀與0.3%硫酸等比例混合滴片3 min，蒸餾水洗；(3)1%草酸漂白數(shù)秒，蒸餾水洗；(4)其他同剛果紅染色；(5)顯微鏡觀察，AL型淀粉樣物質(zhì)呈磚紅色，AA型淀粉樣物質(zhì)不顯色。

2.2.4 甲基紫染色 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)1%甲基紫染色5 min，蒸餾水沖洗；(3)1%醋酸水溶液分化，直至呈現(xiàn)粉紅色或紅色，胞核呈藍色，蒸餾水沖洗；(4)甘油固封；(5)顯微鏡觀察，淀粉樣物質(zhì)亮紫色。

2.2.5 PAS染色 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)0.5%～1%高碘酸氧化5～10 min，蒸餾水速洗1次；(3)Schiff氏液37℃避光染色30～60 min；(4)0.5%偏重亞硫酸鈉(鉀)浸洗2 次，每次1～2 min，流水沖洗5～10 min，蒸餾水速洗2 次；(5)Harris蘇木精染10～15 min，蒸餾水洗；(6)1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，溫水顯藍，自來水沖洗數(shù)分鐘；(7)常規(guī)脫水、透明、封片；(8)顯微鏡觀察，糖類、糖蛋白呈紅色或紫紅色。

2.2.6 Mallory 三色染色 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；(2)重鉻酸鉀液染色10～15 min，蒸餾水沖洗；(3)酸性復(fù)紅液染色2 min，蒸餾水沖洗；(4)苯胺藍液染色20 min，95%乙醇快速分化；(5)常規(guī)脫水、透明、封片。

2.3 細菌分離培養(yǎng) 對肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟用普通瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基做細菌培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上的菌落，進行革蘭染色。鏡檢。

2.4 細菌PCR檢測、測序 細菌純培養(yǎng)后，挑取單個菌落用16S RNA細菌通用引物進行PCR檢測，上游引物序列為gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列為ctahagggtatctaatcct，目的片段大小約為750 bp。

PCR體系：Taq酶12.5 μL，待檢模板1 μL，上下游引物各1 μL，滅菌水9.5 μL，PCR反應(yīng)程序為95 ℃(5 min)；94 ℃(1 min)，55 ℃(30 s)，72 ℃(90 s)，共35 個循環(huán)；72 ℃(8 min)。PCR擴增產(chǎn)物送華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

2.5 掃描電鏡觀察對肺臟組織劃線純培養(yǎng)后的細菌進行掃描電鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 大體剖解觀察 送檢恒河猴的口腔內(nèi)有紅色分泌物，食管內(nèi)有大量黏液，黏膜面潮紅(見中插彩版圖1)，胃臌氣(見中插彩版圖2)，脾臟萎縮(見中插彩版圖3)。腎臟皮質(zhì)區(qū)發(fā)白(見中插彩版圖4)，肝臟表面散在針尖狀出血點(見中插彩版圖5)，肺臟散在多發(fā)性暗紅色小葉性肺炎灶(見中插彩版圖6)。

3.2 組織病理學(xué)觀察結(jié)果

3.2.1 腎臟 出現(xiàn)典型的腎病病理變化。腎小管上皮細胞彌漫性變性、壞死，核固縮或消失。大部分腎小球萎縮，腎球囊被蛋白樣物質(zhì)填充，腎間質(zhì)出血、水腫，未見炎性細胞浸潤(見中插彩版圖7，8)。

3.2.2 肺臟 肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔被淋巴細胞和大面積蛋白樣滲出物填充(見中插彩版圖9)。

3.2.3 心臟 心肌纖維斷裂呈波浪狀，變性、壞死(見中插彩版圖10)。

3.2.4 脾臟 脾臟白髓萎縮，部分白髓壞死，中央動脈周圍淋巴細胞明顯減少(見中插彩版圖11)。

3.2.5 肝臟 肝竇淤血、水腫(見中插彩版圖12)。

3.3 腎臟特殊染色結(jié)果 腎臟的特殊染色結(jié)果顯示，剛果紅染色呈磚紅色(見中插彩版圖13，14)，高錳酸鉀處理后，剛果紅染色無陽性(見中插彩版圖15)。甲基紫染色背景藍紫色，淀粉樣物質(zhì)呈亮紫色(見中插彩版圖16)。PAS染色顯示，腎小球、腎小管基底膜呈深紅色，腎小管中出現(xiàn)紅染的均勻物質(zhì)，呈紫紅色(見中插彩版圖17)。三色染色顯示，無明顯纖維增生(見中插彩版圖18)。

3.4 細菌分離培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果 肝臟、腎臟、脾臟和肺臟劃線培養(yǎng)結(jié)果，只有肺的劃線處有細菌菌落生長。挑取此菌落做革蘭染色結(jié)果顯示，肺臟劃線培養(yǎng)后的細菌為短桿狀或鏈狀的藍紫色細菌，為革蘭陽性短桿菌(見中插彩版圖19)。

3.5 掃描電鏡觀察結(jié)果 掃描電鏡觀察顯示，肺臟組織劃線純培養(yǎng)的細菌為形態(tài)一致的平直的桿狀或鏈桿狀菌(見中插彩版圖20)。

3.6 細菌PCR檢測結(jié)果 PCR 擴增結(jié)果顯示，從肺臟的細菌菌落檢測到一條750 bp 大小的DNA條帶(見中插彩版圖21)，與預(yù)期擴增片段相符，而陰性對照未檢測到任何片段，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，登陸GenBank進行blast比對，肺臟中的細菌與現(xiàn)有報道的蠟樣芽孢桿菌同源性高達100%。登錄號：KT239371。

4 討論

恒河猴作為人類進行生命科學(xué)研究重要的實驗動物，與人類的關(guān)系密不可分。根據(jù)文獻報道，恒河猴在與人類疾病相關(guān)的基因及藥物靶位點上有高度的相似性[5]，因此我們應(yīng)當(dāng)重視對恒河猴疾病的診斷。

從大體剖檢變化來看，該病死恒河猴的肺為典型的小葉性肺炎變化，脾臟明顯萎縮，腎臟皮質(zhì)色淡，結(jié)構(gòu)模糊。從組織病理學(xué)觀察結(jié)果來看，肝臟明顯的淤血，肝細胞水腫；出血性滲出性肺炎。腎臟表現(xiàn)出典型的腎病病理變化：腎小球萎縮，部分腎小球代償性腫脹，腎小管出現(xiàn)大面積的變性壞死，而炎癥變化不明顯。

引起腎病的原因很多，腎病的類型也分很多種。常見的腎病包括淀粉樣變性腎病，糖尿病腎病。淀粉樣變性是一組以細胞外淀粉樣物質(zhì)沉積為特征的系統(tǒng)性疾病。根據(jù)沉積物生化成分不同，淀粉樣腎病主要分為淀粉樣輕鏈(AL)和淀粉樣相關(guān)(AA)蛋白兩型。AL 型包括原發(fā)型、伴發(fā)骨髓瘤型，常累及心、舌、胃腸道、神經(jīng)和皮膚；AA型又稱繼發(fā)型淀粉樣變性，常累及肝、腎、腎上腺、脾[6]。而剛果紅和甲基紫兩種染料與淀粉樣物質(zhì)有著極強的親和力[7]，故臨床上常用于淀粉樣物質(zhì)沉積的檢測。本病例中腎小球的血管球周圍，腎小管管腔內(nèi)均呈磚紅色，甲基紫染色呈亮紫色，說明在壞死的腎小球和腎小管等部位有大量淀粉樣物質(zhì)沉積。經(jīng)過高錳酸鉀處理之后的剛果紅染色可以區(qū)分淀粉樣變的輕鏈蛋白型(AL 型)和淀粉樣蛋白型(AA 型)[8]。從中插彩版圖15中可以看到，腎臟組織內(nèi)幾乎沒有陽性信號，說明該病變可能與淀粉樣蛋白型有關(guān)，即繼發(fā)型淀粉樣變性腎病。PAS染色能夠顯示糖類物質(zhì)，對糖尿病腎病的鑒別診斷也有一定的指導(dǎo)意義[9]。本病例中腎小球、腎小管基底膜顯色清晰，無明顯增厚，無典型的糖尿病腎病病理變化。Mallory三色染色顯示腎臟無明顯的纖維增生。

PCR擴增結(jié)果顯示，肺臟為蠟樣芽孢桿菌感染、肝臟、脾臟、心臟、腎臟未檢測出細菌。雖然蠟樣芽孢桿菌是一種食源性細菌，當(dāng)機體免疫力下降或某些重病后期，蠟樣芽孢桿菌可引起腦膜炎、肺炎或敗血癥，并常見于新生胎兒感染[4]。Edward J.Bottone[10]報道過蠟樣芽孢桿菌引起人全身性感染的病例，該報道觀察發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌可引起人明顯的呼吸道損傷。Dabscheck G[11]曾報道，蠟樣芽孢桿菌感染引起兒童白血病的病例。蠟樣芽孢桿菌雖為條件致病菌，但其致病性仍舊不能忽視。本病例中，我們在病死恒河猴的肺臟中分離培養(yǎng)出了細菌菌落，經(jīng)PCR檢測，擴增產(chǎn)物進行測序，登陸GenBank登錄號：KT239371對比分析結(jié)果顯示，與現(xiàn)有報道的蠟樣芽孢桿菌同源性高達100%。表明該病死恒河猴感染了蠟樣芽孢桿菌，引起恒河猴發(fā)生肺炎和急性腎病。

目前，條件致病菌感染越來越受到人們的重視。實驗動物生活環(huán)境被污染，飼養(yǎng)管理方式不當(dāng)，都會造成機體抵抗力下降，條件致病菌傳播，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟損失。因此，我們應(yīng)當(dāng)重視對蠟樣芽孢桿菌等一系列食源性條件致病菌，保持環(huán)境衛(wèi)生，做好相關(guān)生物安全防護工作，嚴(yán)格衛(wèi)生管理制度，以保障人和實驗動物的安全。

[1] 孫巖松，裴相元，彭傳貴，等.北京地區(qū)恒河猴試驗性繁殖及部分生物學(xué)特性觀察[J].中國實驗動物學(xué)報，1998(02)：1-8.

[2] 王衡，遠立國，喬宏勝，等.恒河猴結(jié)核病的病理組織學(xué)診斷[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49(4)：25-28.

[3] Rasko D A，Altherr M R，Han C S，et al.Genomics of the Bacillus cereus group of organisms[J].FEMS Microbiol Rev，2005，29(2)：303-329.

[4] Drobniewski F A.Bacillus cereus and related species[J].Clin Microbiol Rev，1993，6(4)：324-338.

[5] Yan G，Zhang G，F(xiàn)ang X，et al.Genome sequencing and comparison of two nonhuman primate animal models，the cynomolgus and Chinese rhesus macaques[J].Nat Biotechnol，2011，29(11)：1019-1023.

[6] 楊曉青，張秀輝，胡章學(xué).淀粉樣變性腎病的臨床病理研究[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2006(02)：165-168.

[7] 徐斌，陳俊拋，劉輝，等.兩種改進的甲醇剛果紅染色[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2001(02)：174.

[8] 肖紅波，劉瑞洪，袁曙光，等.20 例腎淀粉樣變的臨床與病理特點分析[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010(01)：43-47.

[9] 李丹清，王穎，周桂玲，等.糖尿病腎病大鼠腎小管與腎小球病變的順序及其意義[J].中華糖尿病雜志，2004(03)：68-73.

[10] Bottone E J.Bacillus cereus，a volatile human pathogen[J].Clin Microbiol Rev，2010，23(2)：382-398.

[11] Dabscheck G，Silverman L，Ullrich N J.Bacillus cereus Cerebral Abscess During Induction Chemotherapy for Childhood Acute Leukemia[J].J Pediatr Hematol Oncol，2015.

A diagnostic report of nephropathy caused byBacilus cereus

LI Heng ， SHE Rui-ping ， WU Qiao-xing ， SHI Rui-han ， HU Feng-jiao ， LI Wei ， ZHANG Yang

(College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

In this study，etiology，histopathology，micro pathology and molecular biology were used to study a case of bacillus cereussecondary in rhesus from a research center of Beijing.The results showed that the rhesus suffered from nephropathy，and secondary infection with bacillus cereus，leading to theeffusion pneumonia，respiratory disorders, and death.

rhesus ； bacillus cereus ； nephropathy ； amyloidosis

SHE Rui-ping

2015-09-10

李恒(1990-)，男，碩士生，研究方向為動物源性食品安全方向，E-mail：liheng1990824@qq.com

佘銳萍，E-mail：sheruiping@126.com

S852.61+6

A

0529-6005(2016)10-0096-03