任　俊，馬慧萍，高榮敏，吳金華，蒙　萍，賈正平

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血管內(nèi)皮生長因子在急性減壓缺氧小鼠肺組織中的表達(dá)研究

任俊，馬慧萍，高榮敏，吳金華，蒙萍，賈正平

[摘要]目的研究血管內(nèi)皮生長因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)在急性減壓缺氧小鼠肺組織中的表達(dá)及意義。方法采用低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙分別模擬海拔6000 m和8000 m高原缺氧環(huán)境，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對照組、缺氧6、9、12、24、48、72 h組，每組10只。HE染色切片觀察缺氧不同時(shí)間小鼠肺組織病理學(xué)的改變情況，免疫組織化學(xué)法檢測肺組織VEGF的表達(dá)水平差異及其規(guī)律。結(jié)果缺氧各組肺組織肺泡間質(zhì)薄厚不均，肺泡大小不一，部分肺泡腔內(nèi)見少量紅細(xì)胞，血管擴(kuò)張充血出血，且隨海拔的增加病理性狀況愈嚴(yán)重；VEGF陽性表達(dá)強(qiáng)度半定量評分較正常對照組顯著增加(P<0.01)，且隨海拔的增加及缺氧時(shí)間的延長表達(dá)增加。結(jié)論減壓缺氧能造成小鼠肺組織損傷，呈現(xiàn)水腫病理表現(xiàn)，并刺激VEGF分泌，最終加重肺水腫和誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長因子；減壓缺氧；急性高原?。环谓M織

缺氧是許多疾病的一個基本病理過程，與包括急性高原病在內(nèi)的心血管疾病、中風(fēng)等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。高原缺氧是引起高原肺水腫的重要因素，有研究報(bào)道，在進(jìn)入海拔3700 m以上高原的人群中，高原肺水腫的發(fā)病率為0.5%～2%。高原肺水腫起病急、進(jìn)展快、危害大，主要是因高原缺氧引起機(jī)體肺動脈壓增高、肺血容量增加、肺微循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致液體滲漏至肺間質(zhì)和肺泡而引起的一種高原特發(fā)病。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)不但能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，而且在缺氧性肺水腫形成機(jī)制中起重要作用，這些相關(guān)研究成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。課題組前期研究表明急性減壓缺氧能使小鼠腦、心組織中VEGF表達(dá)升高，且隨著缺氧時(shí)間的延長，其表達(dá)明顯增加，從而導(dǎo)致血管通透性增加，組織損傷也愈加明顯[2]。本實(shí)驗(yàn)擬采用低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙建立模擬急性高原缺氧小鼠模型，觀察肺組織的組織病理狀態(tài)，并采用免疫組化方法檢測損傷肺組織中VEGF蛋白的表達(dá)，探討急性高原缺氧損傷后VEGF蛋白在肺組織中的變化情況。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性Balb/c小鼠130只，體重18~22 g，購自蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科，許可證編號：SYXK(軍)2012-0020，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科。所有實(shí)驗(yàn)動物給予充足、潔凈的飲水和食物，置于12 h晝夜循環(huán)的恒溫(23℃)環(huán)境中。所有對于實(shí)驗(yàn)動物的操作符合相關(guān)倫理要求，已最大限度的保障實(shí)驗(yàn)動物的福利，避免非必要的損傷性處理。

1.2儀器與試劑FLYDWC50-IIA型低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)貴州雷航空軍械有限責(zé)任公司)；倒置顯微鏡(奧林巴斯)；高速離心機(jī)(德國Appendorf公司)；水浴鍋(上海醫(yī)療器械七廠)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；TB-718E型生物組織自動包埋機(jī)(湖北泰雅電子技術(shù)有限公司)；冷凍切片機(jī)、ZT-12J1生物組織自動脫水機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)(購于湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；多克隆抗體Rabbit polyclonalto VEGF(購于Abcam)；抗體稀釋液、SABC免疫組化試劑盒(包括二抗)、DAB顯色液(購于武漢博士得生物工程有限公司)；PBS磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液(購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1模擬海拔6000 m和8000 m急性高原缺氧小鼠實(shí)驗(yàn)：取SPF級健康雄性BALB/c小鼠130只，飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后按照6000 m和8000 m兩種缺氧環(huán)境隨機(jī)分成正常對照組，缺氧6、9、12、24、48、72 h組，每組10只。正常對照組小鼠不缺氧，分別將其余各組小鼠放入低壓低氧動物實(shí)驗(yàn)艙模擬6000 m和8000 m海拔缺氧環(huán)境。缺氧時(shí)以10 m/s的速度升至6000 m或8000 m海拔，維持相應(yīng)缺氧時(shí)間，完成缺氧后于10 min內(nèi)快速下降海拔高度使艙內(nèi)氣壓與外界大氣壓相同。小鼠完成缺氧處理后立即頸椎脫臼致死，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶Ψ谓M織進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.3.2肺組織病理觀察：各組小鼠完成缺氧處理后，取出各組小鼠的肺組織，以生理鹽水洗凈血液，立即浸入10%甲醛中固定。各個樣本進(jìn)行石蠟包埋、組織切片、染色等相應(yīng)的處理，最終用顯微鏡觀察。

1.3.3肺組織VEGF的表達(dá)：免疫組織化學(xué)處理步驟如下：①取各組肺組織標(biāo)本的石蠟切片放至烘箱；②脫蠟；③加入3% H2O2滅活內(nèi)源性酶；④95℃高溫修復(fù)抗原；⑤加入BSA封閉液；⑥加入一抗：一抗稀釋比例1︰150；⑦加入二抗；⑧加入SABC；⑨DAB顯色，控制反應(yīng)時(shí)間；⑩蘇木素復(fù)染；封片。每張切片隨機(jī)選取3個200倍高倍視野，背景為紫藍(lán)色，參照Harsha等[1]標(biāo)準(zhǔn)，對VEGF陽性表達(dá)強(qiáng)度行半定量評分：細(xì)胞未著色為0分，散在細(xì)胞著色(淺黃色)為1分，彌漫性弱陽性著色(淺棕黃色)為2分，彌漫性中等強(qiáng)度著色(棕黃色)為3分，彌漫性強(qiáng)陽性著色(棕褐色)為4分。

2結(jié)果

2.1模擬海拔6000 m高原缺氧小鼠肺組織顯微結(jié)構(gòu)觀察如圖1所示，光鏡下正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔大小一致，肺泡間質(zhì)清晰；與正常對照組相比，模擬海拔6000 m缺氧6 h組小鼠肺泡間質(zhì)薄厚不均，肺泡大小不一；缺氧9 h組和12 h組小鼠肺泡間質(zhì)增厚，部分肺泡腔內(nèi)見少量紅細(xì)胞，血管充血；缺氧24 h組較12 h組小鼠損傷嚴(yán)重，且部分肺泡腔見少許滲出液；缺氧48 h和72 h組小鼠肺間質(zhì)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，血管充血出血，肺泡腔內(nèi)見紅細(xì)胞及少量含鐵血黃素，部分肺泡擴(kuò)張。

2.2模擬海拔6000 m高原缺氧小鼠肺組織VEGF蛋白的表達(dá)VEGF在胞漿表達(dá)，陽性胞核呈藍(lán)色，胞漿著棕黃色，顏色深淺和著色強(qiáng)弱表明VEGF表達(dá)水平的高低。如圖2、圖5所示，與正常對照組相比，模擬海拔6000 m各缺氧組小鼠肺組織胞漿著色深，著色面積增大，即VEGF表達(dá)明顯增加，且隨著缺氧時(shí)間的延長，VEGF表達(dá)增加更為顯著。

2.3模擬海拔8000 m高原缺氧小鼠肺組織顯微結(jié)構(gòu)觀察如圖3所示，光鏡下正常對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間質(zhì)薄厚均勻清晰可見；與正常對照組相比，模擬海拔8000 m缺氧6 h組小鼠肺泡間質(zhì)增厚，薄厚不均，肺泡腔大小不一；缺氧9 h組較6 h組小鼠損傷稍重，部分血管擴(kuò)張充血；缺氧12 h組小鼠血管明顯擴(kuò)張充血出血，肺泡大小不一，部分肺泡腔內(nèi)見較多紅細(xì)胞及少量滲出液；缺氧24 h組較12 h組小鼠損傷稍緩和；缺氧48 h組和72 h組較24 h組小鼠病理變化顯著，血管明顯擴(kuò)張充血出血，肺泡腔內(nèi)見較多紅細(xì)胞及大量滲出液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬海拔8000 m高原缺氧環(huán)境對小鼠肺組織的損傷較海拔6000 m嚴(yán)重。尤其在缺氧12 h組和缺氧更長時(shí)間的小鼠中，這種損傷程度更加嚴(yán)重的趨勢愈明顯，壞死的細(xì)胞越來越多，組織結(jié)構(gòu)被破壞得越來越嚴(yán)重。

圖1　模擬海拔6000 m高原缺氧不同時(shí)間對小鼠肺組織顯微結(jié)構(gòu)的影響(HE×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖2　模擬海拔6000 m高原缺氧不同時(shí)間對小鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖3　模擬海拔8000 m高原缺氧不同時(shí)間對小鼠肺組織顯微結(jié)構(gòu)的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

2.4模擬海拔8000 m高原缺氧小鼠肺組織VEGF蛋白的表達(dá)如圖4、圖5所示，與正常對照組相比，模擬海拔8000 m各缺氧組小鼠肺組織胞漿著色深，著色面積增大，即VEGF表達(dá)明顯增加，且在9 h段表達(dá)顯著增加，此后隨時(shí)間延長，VEGF表達(dá)增加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠在模擬海拔8000 m缺氧條件下，為了應(yīng)對比模擬海拔6000 m更為嚴(yán)重的缺氧環(huán)境，顯著增加了VEGF的表達(dá)，進(jìn)而加重肺部細(xì)胞所受到的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，肺泡破損。

圖4　模擬海拔8000 m高原缺氧不同時(shí)間對小鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖5　模擬海拔6000 m與8000 m高原缺氧不同時(shí)間對小鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響注：與正常對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

3討論

高原缺氧是引起高原肺水腫的重要因素。機(jī)體缺氧后，為了代償需要，血管容易增生，而VEGF是促血管增生、增加血管通透性的關(guān)鍵因子[2]。本實(shí)驗(yàn)通過模擬高原急性缺氧環(huán)境，研究肺組織的形態(tài)學(xué)方面的變化，并從蛋白水平研究VEGF的變化情況。

模擬高原缺氧小鼠肺組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，光鏡下正常對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔大小一致，肺泡間質(zhì)清晰；海拔6000 m小鼠隨著缺氧時(shí)間的延長損傷程度逐漸加重：6 h組肺泡間質(zhì)薄厚不均，肺泡大小不一； 9 h和12 h組肺泡間質(zhì)增厚，部分肺泡腔內(nèi)見少量紅細(xì)胞，血管充血；24 h組較12 h組嚴(yán)重且部分肺泡腔見少許滲出液；48 h和72 h組肺間質(zhì)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，血管充血出血，肺泡腔內(nèi)見紅細(xì)胞及少量含鐵血黃素，部分肺泡擴(kuò)張；海拔8000 m小鼠在相同缺氧時(shí)間點(diǎn)較6000 m小鼠的損傷程度更為明顯，其中24 h組雖較12 h組稍緩和，但48 h組和72 h組水腫情況更為嚴(yán)重，這可能是由于在較高海拔下機(jī)體代償性反應(yīng)加重所致，具體原因有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧會造成小鼠肺組織呈現(xiàn)病理性損傷，有水腫現(xiàn)象，且損傷程度與海拔高度及缺氧時(shí)間有關(guān)。

VEGF是血管新生和生成調(diào)節(jié)最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，可以強(qiáng)有力的促進(jìn)新生血管形成，在創(chuàng)傷愈合、慢性炎癥時(shí)的血管增生、腫瘤血管的形成等過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。然而，作為一種促炎癥因子，VEGF能夠增加血管通透性[6-8]。低氧誘導(dǎo)VEGF生成，當(dāng)機(jī)體內(nèi)VEGF的水平達(dá)到一定濃度時(shí)，VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管滲漏，促進(jìn)急性高原病的惡化[9-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧能造成小鼠肺組織損傷，呈現(xiàn)水腫病理表現(xiàn)，并刺激VEGF分泌，激發(fā)新生血管形成。缺氧后，肺組織中VEGF的表達(dá)升高，且隨模擬海拔的增高及缺氧時(shí)間的延長，表達(dá)顯著增加。VEGF是通過與受體的靶向結(jié)合發(fā)揮調(diào)控血管生成等功能的[12-13]。受體VEGFR-2參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能[14-15]，該受體被VEGF激活后，作用于酪氨酸激酶傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂[16-17]。同時(shí)，VEGF增強(qiáng)囊泡器的功能，提高血管通透性，從而增加纖維蛋白原等物質(zhì)外滲，導(dǎo)致血漿滲透壓降低，引起組織水腫[18-19]。

高原肺水腫是一種非心源性的肺水腫，發(fā)生在急進(jìn)海拔3000 m以上的健康人群中，缺氧性肺血管擴(kuò)張?jiān)斐傻臐B漏是其發(fā)病的主要原因。VEGF對于缺氧機(jī)體來說具有雙刃劍的作用，一方面，VEGF增加有利于缺氧狀態(tài)下機(jī)體的代償；另一方面，VEGF能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)增加會導(dǎo)致血管通透性增加，血漿外滲，導(dǎo)致組織呈現(xiàn)水腫病理性變化。VEGF適量升高，誘發(fā)新血管形成而不會引起心腦肺等器官的病理變化，有利于提高機(jī)體對高原缺氧的適應(yīng)能力。因此，我們將對VEGF進(jìn)行深入研究，篩選作用于VEGF的有效藥物，通過調(diào)控VEGF，使其適量表達(dá)，從而應(yīng)用于治療高原肺水腫、急性高原病等疾病。

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(收稿時(shí)間：2015-09-10修回時(shí)間：2015-10-20)

腫瘤基礎(chǔ)與臨床

·論著·

VEGF Expression on Lung Tissues of Mice under Acute Depression and Hypoxia Condition

REN Jun, MA Hui-ping, GAO Rong-min, WU Jin-hua, MENG Ping, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and significance of vascular endothelial growth factor (VEGF) in lung tissues of mice under acute depression and hypoxia condition. MethodsThe hypobaric and mionectic chamber was used to simulate 6000 m and 8000 m high altitude hypoxia environment, and BALB/c mice were randomly divided into normal group (n=10), hypoxia for 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h groups (n=10 for each group). The pathological changes of lung tissues in different hypoxia times were observed using HE staining, and VEGF expressions and its rule of lung tissues were detected using immunohistochemistry method. ResultsIn hypoxia groups, the tissues between pulmonary alveoli were different thickness and sizes, and a small amount of red blood cells was observed in some pulmonary alveoli. The vascular extension, hyperemia and hemorrhage were found, and pathological changes were more serious with increasing altitude. Compared with those in normal group, the positive VEGF expression of intensity semi-quantitative scores were significantly increased in hypoxia groups (P<0.01), and VEGF expressions were increased with increasing altitude and prolonged hypoxia time. ConclusionThe lung tissues may be damaged in mice under depression and hypoxia condition, and it can induce edema and stimulate VEGF secretion, which may result in more serious pulmonary edema and cell death.

[Key words]Vascular endothelial growth factor； Depression and hypoxia； Acute mountain sickness； Lung tissues

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.002

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號]R341 R977.6A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0005-05

[通訊作者]馬慧萍，E-mail：mahuipingcxr@yahoo.com

[基金項(xiàng)目][作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室